Persistencia de esporas Bacillus thuringiensis en hojas de fríjol, maiz y en el suelo agrícola (página 2)

MATERIALES Y MÉTODOS

I. Origen de las esporas de B. thuringiensis.

Se colectaron 60 muestras de suelos de una zona agrícola del municipio de Irapuato, Gto, .México Para obtener las esporas de B. thuringiensis, se suspendieron 10 g de cada suelo en un matraz de 250 mL con 90 mL de solución salina estéril y se pasteurizó a 65°C por 13 min. De esta suspensión se tomaron 0.2 mL para sembrar en agar nutritivo, el medio de cultivo fue incubado a 30°C durante 72 h, para buscar las colonias características de la bacteria y al microscopio detectar células vegetativas con esporas y cristales o sólo esporas y cristales.

Al aislado de suelo se le denominó B. th-JM. Esta técnica también se utilizó para aislar las esporas de B. thuringiensis subespecie krustaki HD-1 del producto "Dipel" (Shell, Co.). Ambos aislados fueron sometidos a un análisis de plásmidos para corroborar su presencia con la producción de cristales (37) en el Laboratorio de Control de Plagas del Algodón del USDA de Waco, Texas, EUA.. Las esporas de B. th HD-1 y B. th-JM se conservaron en suelo esterilizado y en agar triptosa fosfato en refrigerador.

II. Selección de mutantes de B. thuringiensis resistentes a penicilina.

Para determinar la viabilidad de las esporas de B. th-JM y B. th HD-1 en el filoplano u hojas de maíz y de fríjol, incluso en el suelo y evitar interferencias de los microorganismos autóctonos de estos ambientes, se seleccionó un mutante estable de B. th-JM resistente á 50 pg/mL de penicilina (P) la que se adicionó en agar nutritivo (AN) y 60 pg/mL del mismo antibiótico en AN para recuperar las esporas de B. th HD-1 (1, 53) de estos sitios.

III. A) Persistencia de las esporas de B. thuringiensis en filoplano de plantas.

En este experimento se germinaron y crecieron semillas sin desinfectar de maíz (Zea mays L.) y de fríjol (Phaseolus vulgaris L.) en macetas de 3.0 Kg de capacidad con arena estéril (121°C/1 h/3 días); cuando las plantas desarrollaron el segundo par de hojas verdaderas se les aplicaron independientemente esporas de 72 h de edad de B. th-JM y B. th HD-1. Se realizaron cuatro aspersiones con un aplicador : cada aspersión equivale a 1.5 x 105 esporas de B. thuringiensis en 0.12 mL, según modificaciones de la técnica descrita por Ercolani (1978) y Haefele & Lindow (1987). Luego las plantas fueron cubiertas con bolsas de polietileno y colocadas en un invernadero en una temperatura de 24-29°C. Las macetas se alimentaron con la solución nutritiva de White para plantas (6).

El número de esporas asperjadas al inicio del experimento y su viabilidad en las hojas, se determinó por la técnica de las hojas agitadas (50) en donde secciones de 4 hojas/planta, de 5 á 6 mm se suspendieron en matraces Erlenmeyer de 250 mL con 20 mL de solución salina estéril, se agitaron a 250 rpm/30 min para realizar una doble siembra en ANP e incubar á 30°C por 4 días, la primera por inoculación directa de la suspensión de las hojas y obtener la población total de las células vegetativas y con espora, la segunda después de pasteurizar las suspensiones á 65°C/13 min y sembró en ANP para determinar sólo el número de esporas viables en las hojas de las plantas.

Este procedimiento se usó durante 15 días hasta no detectar esporas vivas de B. thuringiensis en el ANP y se tomaron al azar 10 colonias para observar al microscopio y asegurar con una tinción simple con cristal violeta 0.1 %/20 seg, bacilos con esporas y cristales, este ensayo se realizó por triplicado.

III. B) Viabilidad de las esporas de B. thuringiensis en suelo.

En este ensayo para determinar la capacidad de persistencia individual de las esporas de B. th-JM y B. th HD-1 se inocularon 1.0 X 104 esporas/g de suelo en recipientes de aluminio de 200 g que contenían 100 g de suelo no esterilizado con textura arcillosa-limosa con un valor mediano en materia orgánica de 2.4 % , nitrógeno 0.8 % y pH 6.9. Otros 100 g del mismo suelo fueron esterilizados en autoclave á 121°C/2 h/3 días para eliminar la competencia nativa y observar la viabilidad de una cantidad similar de las esporas de B. th-JM y B. th HD-1 los suelos se incubaron á 30°C por 10 días, a intervalos de 24 h, se determinó el número de esporas viables durante ese período, para ello se tomaron 10 g de cada suelo, se suspendieron en 90 mL de solución salina y se sembraron directamente en ANP para obtener el número total de células vegetativas y con espora, esta suspensión fue luego pasteurizada (65°C por 13 min) y sembrada en ANP para conseguir sólo el número de esporas viables y por diferencia entre el número total y el número registrado después de pasteurizar, la cantidad de esporas viables de B. thuringiensis en cada suelo no y esterilizado, este ensayo se repitió 3 veces.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Persistencia de las esporas en las hojas de maíz y fríjol.

La figura 1 muestra la pobre viabilidad de las esporas de B. th-JM en el sistema foliar de las plantas de maíz y de fríjol, lo que indica que las esporas de B. th-JM no respondieron a los estímulos de los exudados foliares, contrario a la respuesta positiva de crecimiento de las bacterias Gram negativas autóctonas epífitas observada en el maíz y en el fríjol (9, 10, 17, 20). Otra causa de la pérdida de viabilidad de las esporas de B. th-JM fue su sensibilidad a la desecación (5, 38) y por su exposición a la radiación solar (18, 23, 26), además de que se confirmó por el USDA de Waco, Tx. EUA, la presencia de plásmidos en los aislados B. th-JM y B. th HD-1 que codifican para la producción del cristal, que permiten la acumulación del ácido dipiconílico (5, 12, 13) y de las proteínas solubles en ácido (36, 48) en la cubierta de la espora que ocasionaron la disminución de la resistencia de las esporas de B. th-JM y B. th HD-1 a estos factores ambientales.

La figura 2 muestra que la viabilidad de las esporas de B. th HD-1 fue breve, causada en principio por su incapacidad de respuesta a los exudados foliares del maíz y del fríjol (10, 32, 49), lo anterior sugiere que la germinación de las esporas en términos nutricionales es más compleja de lo que los componentes de los exudados del filoplano le prorcionan (29, 38, 41), debido su asociación con los insectos Pectinophora gossypiella y Anagasta kuehniella (19) de donde originalmente se aisló, como en el caso de otras especies de Bacillus: B. larvae y B. popillae cuyo grado de dependencia bioquímica con los insectos los hace más exigentes desde el punto de vista nutricional, que otras especies de B. thuringiensis (14,15), lo que su vez explica por qué la aspersión del bioinsecticida dado su corto período de actividad tóxica, debe realizarse puntualmente sobre las hojas sólo durante los primeros estadios de crecimiento de la forma larvaria de la plaga para asegurar un éxito relativo en su control (31, 37) pues se trata de un insecticida bacteriano que es eficaz, sólo si el insecto ingiere rápidamente en dosis relativamente elevadas ( 15, 27).

Viabilidad de las esporas en suelo, la figura 3 muestra que tanto las esporas de B. th-JM como las de B. th HD-1, fueron poco viables en el suelo esterilizado únicamente dos días y aunque la esterilización añadió más nutrientes (55), esto no prolongó su persistencia, la pobre supervivencia de las esporas en el suelo, indica la presencia de sustancias inhibidoras de su germinación (4, 30) como ya esta probado (56), de acuerdo con estos resultados, el suelo parece ser para las esporas de los aislados B. th-JM y B. th HD-1 un reservorio más que un hábitat y apoya la hipótesis de que las esporas de algunas subespecies de B. thuringiensis necesitan para persistir en la naturaleza de la asociación con organismos superiores como los insectos (12, 14). Las esporas de ambos aislados de B. thuringiensis inoculadas en los suelos no esterilizados perdieron su viabilidad con la misma velocidad que las introducidas en los suelos esterilizados, principalmente a causa de la competencia y la predación de sus esporas por los microorganismos autóctonos (22, 33, 40, 56), lo que explica por qué los productos comerciales a base de las esporas y cristales de B. th HD-1 (31), no reportan efectos residuales en el suelo para intoxicar y causar epizootias en insectos plaga del suelo y sugiere que las esporas de B. th-JM y B. th HD-1 no pertenecen a este hábitat.

Se concluye que es necesario investigar más sobre la supervivencia de las esporas de variedades de B. thuringiensis en la naturaleza, que permitan seleccionar y explotar aquellas con mejores posibilidades de persistencia en ambientes agrícolas para el control biológico de insectos-plaga.

Agradecimientos. Al proyecto 2.7 de la CIC (2005-2006) de la UMSNH por las facilidades, se dedica este trabajo a Hugo Arturo y Miguel Angel Torres Sanchez

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Juan Manuel Sánchez-Yáñez

Laboratorio de Microbiología ambiental, Instituto de Investigaciones Químico Biológicas-Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo Morelia, Mich, México.

Juan José Peña-Cabriales

CINVESTAV-IPN. Unidad Irapuato, Gto, México.