Transformación de Escherichia coli mediante diversas técnicas de biología molecular

2. Resumen
4. Objetivos
5. Materiales y métodos
6. Síntesis de la sonda radiactiva por PCR y purificación
7. Transferencia por la técnica de Southern Blot
8. Subclonado
9. Trasformación de bacterias con los productos de ligación
10. Purificación (MINIPREP) de DNA plasmídico. Inducción de la expresión génica y visualización de actividad
11. Identificación de clones positivos por restricción
12. Geles de proteínas e identificación de la proteína de fusión en geles nativos y desnaturalizantes
13. Resultados
14. Síntesis de la sonda radioactiva por el método de PCR
15. Purificación de los fragmentos de ADN, a partir del gel de agarosa
16. Purificación de ADN plasmídico, inducción de la expresión génica
17. Procesado de los cultivos inducidos y purificación de proteínas recombinantes utilizando glutation agarosa
18. Purificación de GFP e identificación de la proteína en geles nativos y desnaturalizantes
19. Conclusiones
20. Bibliografía

Resumen

Se realizó un subclonado del gen que codifica para la `green fluorescent protein` (GFP) de de Aequorea victoria en un vector de expresión procariota que permite expresar la proteína recombinante con actividad biológica. Se partió de un clon proveniente de una biblioteca genómica de A. victoria, se realizó un mapa de restricción con enzimas de alta y baja frecuencia de corte. Luego se realizó un `southern-blot` con sondas sintetizadas por PCR para determinar en que fragmentos de restricción se encontraba el gen que codifica para la GFP. Se realizó el subclonado del gen que cidifica para GFP, ligándolo en un vector de expresión procariota. La digestión del vector y del inserto se realizó con dos enzimas de restricción; y ademas el vector fue fosfataseado para evitar el religado del mismo, y además direccionar el inserto. El plásmido de expresión utilizado fusiona el inserto a GST, lo que puede utilizarse para facilitar la purificación. Luego de transformar bacterias (E. coli) se realizó una inducción de la expresión de la proteína recombinante. Se purificó la misma aprovechando el dominio GST y se observó la actividad enzimática de la misma. Ademas se realizaron geles nativos y desnaturalizantes para caracterizar dicha proteína.

Introducción

inicialmente. Esto nos indica que la transmisión horizontal no fue evidenciada. Puede que esto haya sido producto de la baja densidad poblacional utilizada en los experimentos realizados (Smith y Contreras, 1998).

Objetivos

El objetivo de este práctico es lograr la expresión de una proteína recombinante con actividad biológica (proteína verde fluorescente codificada por un gen de Aequorea victoria) en Escherichia coli, utilizando diversas técnicas de biología molecular.

Materiales y métodos

Digestión enzimática de un clon de ADN

Se realizó una digestión enzimática a partir de un clon de una biblioteca genómica que poseía un inserto de 6kb clonado en el plásmido pRibotex (3kb). Dentro del inserto se encontraba el gen completo de la `green fluorescent protein` (GFP) de aproximadamente 700pb. Con el fin de localizar la GFP dentro del inserto clonado, se realizó un mapeo de restricción, diseñando un protocolo de digestión de DNA plasmídico con una serie de enzimas de restricción de alta (Grupo 1) y baja frecuencia de corte (los demás grupos). Estas fueron seleccionadas adecuadamente de forma tal que incluyan las mismas condiciones de reacción (buffer, temperatura, pH de reacción, etc.). Se utilizaron 5U de enzima de restricción por cada g de ADN, con seroalbúmina bovina (BSA), se incubaron a 37 grados durante 2 horas a fin de evitar `star activity`. Las enzimas empleadas se detallan en la tabla 1.

Tabla 1 – Enzimas de Restricción utilizadas para la digestión enzimática y el reastreo.