Transformación de Escherichia coli mediante diversas técnicas de biología molecular (página 2)

Para analizar el producto de las digestiones enzimáticas se realizó una electroforesis en gel de agarosa con las muestras digeridas, utilizando el protocolo de preparación del gel y de las muestras detallado en la guía de TP de la cátedra. El fundamento de esta técnica es que es que el DNA en presencia de un campo eléctrico migra de forma inversamente proporcional al logaritmo de la cantidad de sus pares de bases, esto se debe a que el DNA está cargado negativamente a pH neutro, ya que los grupos fosfato se encuentran presentes a lo largo de toda la molécula. La visualización de las muestras se realizó con exposición al UV en presencia de Bromuro de etidio (que es un agente químico que se intercala entre las bases nitrogenadas del DNA).

Síntesis de la sonda radiactiva por PCR y purificación

Con el fin de localizar el gen de la GFP en las muestras digeridas fue necesario realizar un Southern blot sobre las mismas. Para ello, previamente, se sintetizó una sonda radioactiva por el método de PCR. Para optimizar el proceso, se realizó una PCR sobre un clon parcial de la GFP utilizando distintas condiciones (variando parámetros de reacción). Los protocolos PCR fueron desarrollados teniendo en cuenta los datos suministrados en la guía de TP y en los manuales de laboratorio.

A continuación se muestran las condiciones empleadas en cada caso para la reacción:

En las reacciones de PCR se incluyó la Taq polimerasa (DNA polimerasa de Thermus aquaticus), buffer adecuado para el correcto plegamiento de la proteína, Mg 2+ (cofactor enzimático de la Taq polimerasa), dNTPs (en exceso estos pueden unirse al Mg2+ reclutándolo) y primers específicos. También se calcularon las temperaturas de desnaturalización (Tm) de ambos primers, pues es necesario de que no difieran en mas de 5 grados para poder llevarse a cabo correctamente el apareamiento (`annealing`). Como molde se utilizó el vector pBlueScript II el cual tenía clonado el gen de la GFP. Las condiciones estándar de la reacción utilizadas fueron las siguientes:

[Buffer]=1x

[Mg++]=2mM

[dNTP`s]=100uM

[Taq]=1U/reacción

[DNA]=2ug/reacción

[Primer Reverse]=1ng/reacción

[Primer Forward]=1ng/reacción

Volumen de reacción=20uL

Los productos de PCR fueron resueltos en gel de azarosa, a fin de determinar las condiciones óptimas de reacción. Una vez determinadas estas condiciones, los docentes de la cátedra realizaron una PCR en presencia de citosina marcada radioactivamente (dCTPα32P), para generar la sonda necesaria en la etapa de hibridización del Southern blot.. La purificación de la misma fue realizada por los docentes, utilizando el protocolo detallado en la guía. El proceso de purificación consiste en separar la sonda del nucleótido radioactivo no incorporado. Logrado esto, se puede estimar el rendimiento de la marcación, evitar que levante el fondo de la hibridización y minimizar la exposición innecesaria a altas concentraciones de radioactivos. Este proceso se puede llevar a cabo logrando una precipitación de DNA en partición con solventes orgánicos y centrifugando, o bien mediante una filtración molecular del producto de PCR en una columna de Sephadex G50. En nuestro caso, la sonda fue purificada utilizando el primer método (realizado por los docentes), el cual se basa en la solubilidad del DNA en fase acuosa y la precipitación en presencia de alcohol y alta fuera iónica. La solubilidad del DNA disminuye cuando se encuentran estos dos componentes debido a que las sales quelan el DNA mediante interacciones iónicas y al alcohol varía el coeficiente dieléctrico del agua. Una vez logrado el proceso de síntesis y purificación de la sonda, se procedió a realizar el Southern blot con las muestras digeridas

Transferencia por la técnica de Southern Blot

El DNA luego de ser digerido y corrido en un gel de agarosa fue transferido a un filtro de nylon, con el objetivo de fijarlo para una posterior hibridización. El DNa fue fijado a la membrana utilizando radiación UV o por calentamiento, de manera de formar uniones covalentes entre la matriz de nylon y la muestra. El DNA debe estar desnaturalizado para poder llevarse a cabo el proceso de hibridización con la sonda (scDNA). Para ello se incubó el gel en una solución alcalina con NaOH [0,5M] y NaCl [1,5M]. La sonda también debe estar desnaturalizada para poder hibridizar con el DNA, este proceso fue realizado por calentamiento. Para direccionar la transferencia, se utilizó una serie de papeles absorbentes. Con el fin de bloquear sitios en los cuales el DNA puede unirse inespecíficamente, se incubó el filtro con agitación periódica a temperatura ambiente en una solución con sodio [0,5M], BSA [1%], SDS [7%] y EDTA [0,001M] en buffer fosfato. El proceso de hibridización se llevó a cabo a temperaturas altas y baja fuerza iónica, condiciones que permiten una hibridización específica (alta rigurosidad). Estas condiciones son necesarias debido a que se contaba con una sonda de alta identidad de secuencia con a la muestra. De esta manera, el calor produce una desnaturalización del DNA (separación de las hebras) diferencial, dependiente de la identidad de secuencia, que permite que la sonda que no hibridizó correctamente, se desprenda y no genere una señal errónea (unión inespecífica de la sonda). Asimismo la baja fuerza iónica inestabiliza el DNA que se ha apareado incorrectamente con el mismo fin. El lavado se realiza con el fin de extraer las sondas que no han hibridizado con la muestra. Generalmente el lavado se realiza en condiciones más rigurosas que el proceso de hibridización. Los filtros se expusieron sobre una placa radiográfica hasta la visualización de bandas discretas.

Subclonado

Para lograr la expresión de GFP en Escherichia coli, fue necesario clonar el gen que codifica para GFP en un vector de expresión. Con este fin, se realizó un subclonado (escisión de un inserto de un vector y religado del mismo en otro vector) del gen completo de la GFP, partiendo de este clonado en el vector pGEMTeasy (provisto por los docentes) al vector de expresión de la línea pGEX. Esta línea permite obtener una fusión a la proteína Glutatione-S-Transferasa (GST), que será de gran importancia en el proceso de purificación de la proteína recombinante.

Por medio del análisis de los mapas de restricción de los vectores mencionados anteriormente, se seleccionó la línea pGEX-2T y las enzimas de restricción empleadas para realizar el subclonado. Las enzimas fueron adecuadamente seleccionadas (BamHI y EcoRI) de manera tal de que: la secuencia de reconocimiento de ambas esté presente en el sitio de clonado múltiple de ambos vectores plasmídicos, que al ligar el inserto se respete el marco de lectura tanto de la GST como de la GFT, que requieran las mismas condiciones de reacción, que generen extremos cohesivos (para obtener una mayor eficiencia en la ligación y poder direccionar la inserción del fragmento dentro del vector). Las enzimas que se utilizaron para el clonado del fragmento, no encuentran sitios de restricción dentro de la secuencia que codifica para GFP, pues se deseaba subclonar el gen completo. Se utilizaron 5 unidades de enzima por ug de DNA.

Con el objetivo de ligar el fragmento que contiene el gen completo de la GFP, en el vector pGEX-2T, se realizó una reacción de ligación. Para ello, previamente, se desfosforiló enzimáticamente el vector (sin inserto) con el objetivo de disminuir el religado del mismo, pues la DNA ligasa cataliza la reacción de ligación entre fragmentos de DNA que contengan un extremo 5’ con un grupo fosfato y un extremo 3` con un grupo oxidrilo. Si bien se utilizaron dos enzimas diferentes (BamHI y EcoRI) para generar extremos cohesivos no complementarios, el uso de la fosfatasa disminuye la probabilidad de religado del vector en el caso de que una de las enzimas no digiera. Se incluyó una DNA fosfatasa (CIP-Calf Intestinal Phosphatase) al tubo donde se realizó la reacción de digestión del vector pGEX-2T, calculando previamente la cantidad de enzima necesaria y las condiciones exactas de la reacción (1 Unidad de enzima por pmol de extremos).

Tanto la reacción de digestión del vector pGEM-Teasy-GFP como la reacción de digestión y posterior fostataseo del vector pGEX-2T fueron separadas de las enzimas mediante una corrida electroforetica en gel de agarosa 1%. Se dejó correr hasta obtener una buena resolución, se visualizaron los fragmentos de restricción por exposición al UV y se cortó la banda correspondiente.

Tanto el vector pGEX-2T como el fragmento correspondiente a GFP fueron purificadas utilizando como fundamento la capacidad que posee el DNA de adsorberse al vidrio (resina que posee cargas positivas) en presencia de alta fuerza iónica. Las fuerzas de interacción que se generan entre la resina y el DNA son electroestáticas. Con el fin de evitar la neutralización de estas fuerzas, fue importante mantener el pH ácido de las soluciones.

El procedimiento de purificación que se detalla a continuación fue realizado tanto para el fragmento de DNA obtenido a partir del gel de agarosa, como para el vector fosfataseado, exceptuando el primer paso.

Con el objetivo de derretir la agarosa, se incubó la banda cortada del gel a 50º C (primer paso) en un buffer que poseía una alta concentración de sal (ioduro de sodio) y pH ácido. El ioduro de sodio, desestabiliza las interacciones puente de hidrógeno del polímero de agarosa. Luego de ello, se agregó la resina, resuspendiéndola reiteradas veces con el vórtex. Se procedió a centrifugar, descartando el sobrenadante y se realizó nuevamente un lavado con el buffer anterior. Se centrifugó, se descartó nuevamente el sobrenadante y resuspendió el pellet (DNA unido a la resina) con una solución de lavado (buffer PE), la cual posee alcohol (facilita el lavado de las sales). Se eluyó con agua (aumenta el ph y solubiliza al DNA) el DNA de la resina. Se centrifugó, con el fin de extraer la misma, obteniendo en el sobrenadante el DNA de interés libre.

Para poder diseñar un protocolo de ligación entre el gen de interés y el vector purificado en la etapa anterior, se calculó el rendimiento de dicha etapa en gel de agarosa mediante la exposición al bromuro de etidio. En base a los resultados obtenidos, se pudo calcular las concentraciones de vector e inserto purificados, las cuales resultaron ser 2.5 ng/μl y 5 ng/μl respectivamente. Para establecer la cantidad de inserto a utilizar en la reacciσn de ligación, se utilizó la siguiente ecuación:

(Masa de Vector en ng . Tamaño del inserto en pb/Tamaño de vector en pb) . I/V= Masa del inserto en ng.

Datos: El tamaño del vector es de 4950 pb y el del inserto700pb.

donde I/V es la relación Inserto/Vector. Se utilizaron las siguientes relaciones 1:1 y 3:1 en el proceso de ligación. En esta reacción se incluyó, obviamente, una T4 DNAligasa, la cual puede catalizar la unión de los extremos de DNA entre el vector y el inserto en presencia de ATP, con su buffer correspondiente para que se encuentre en condiciones óptimas (pH, el cofactor Mg 2+, BSA, etc.).

También se incluyeron los siguientes controles:

Controles:

Vector sin inserto y con ligasa: Control de la fostatasa CIP.

Vector sin inserto y sin ligasa: Control de digestión.

Inserto y ligasa : Control de contaminación.

Trasformación de bacterias con los productos de ligación

La transformación es el proceso de captación y asimilación de ADN exógeno desnudo, a partir del medio, por parte de una bacteria. No todas las bacterias son competentes, capaces de adquirir DNA libre del medio, sin embargo en algunas cepas esta capacidad puede inducirse mediante el tratamiento con agentes físicos o químicos. Se transformaron bacterias E. coli con los productos de ligación en presencia de Cl2Ca para inducir la competencia. Se incubaron las ligaciones con las bacterias descongeladas, dejando en hielo durante diez minutos. Luego de ello, tanto las ligaciones como los controles citados anteriormente, se sometieron a un "shock térmico" de 42ºC durante 30 segundos, seguido por una incubación de 2 minutos en hielo. Este tratamiento altera las la membrana externa aumentando su permeabilidad, facilitando de esta forma la incorporación del DNA. Los plásmidos entran a la célula como moléculas de cadena doble intactas, mientras que los ADN lineales, que entran de la misma forma, son degradados por nucleasas citoplásmicas (RecBCD).

Ulteriormente, se procedió a inocular y luego se realizó la recuperación incubando en tubos que contenían TB sin antibiótico (medio de enriquecimiento para bacterias) durante una hora a 37 grados, con agitación. Con el fin de seleccionar las bacterias que incorporaron el producto de ligación, luego se plaquearon las muestras en placas de Petri con agar LB con ampicilina (100ug/mL). El vector de expresión pGEX-2T, contiene una región que codifica para resistencia al antibiótico ampicilina. Utilizando un medio que contenga este antibiótico, es posible seleccionar las bacterias que han incorporado el vector. De esta manera, por lo dicho anteriormente, es esperable que solo sobrevivan las bacterias transformadas.

Purificación (MINIPREP) de DNA plasmídico. Inducción de la expresión génica y visualización de actividad.

La miniprep es una técnica que se utiliza para extraer DNA plasmídico de células bacterianas en suspensión y se basa en el procedimiento de lisis alcalina desarrollada por Birnboim and Doly (Nucleic Acids Research 7:1513, 1979). Este procedimiento toma provecho de que los plásmidos son relativamente pequeños y se encuentran formando una estructura denominada `supercoiled`, mientras que el DNA genómico es mucho más grande y no forma dicha estructura. Esta diferencia en topología permite la precipitación selectiva de DNA genómico y proteínas celulares de plásmidos y de moléculas de RNA. Bajo condiciones alcalinas las células son lisadas, de manera tal que se desnaturalizan todas las moléculas de DNA y proteínas. Cuando la solución es neutralizada por la adición de acetato del potasio, el DNA genómico y las proteínas precipitan debido a que es imposible que renaturalizen correctamente (por su gran tamaño), mientras que los plásmidos renaturalizan correctamente quedando en solución.

Los docentes a cargo de la cátedra realizaron cultivos `over-night` en medio LB con ampicilina la noche anterior a la miniprep, a partir de colonias aisladas que provenían de las transformaciones. Se centrifugaron los cultivos bacterianos crecidos `overnight` (5`-6000rpm) y se descartó el sobrenadante, ya que las bacterias se encuentran en el pellet. El pellet fue resuspendido de forma homogénea en buffer de resuspensión (P1), que contiene RNAasa A (100ug/mL), un buffer que optimiza su actividad enzimática y EDTA, que es necesario para quelar los metales cofactores de las DNAasas. La RNAasa cataliza la hidrólisis del RNA con el fin de evitar una eventual contaminación, pues como se mencionó anteriormente el DNA plasmídico queda en solución junto con todos los RNA. Con el fin de lisar las células se agregó buffer de lisis (P2), el cual incuye SDS y NaOH. El SDS es un detergente iónico que rompe las membranas de las células y desestabiliza todas las interacciones hidrofóbicas que poseen varias macromoléculas en su conformación nativa.  El pH alto que origina el NaOH también desnaturaliza las macromoléculas cambiando la condición de grupos ionizables. Estos dos componentes del buffer, provocan la ruptura de las paredes celulares y desnaturalización de proteínas. La viscosidad de la solución se incrementa debido al aumento en la concentración de macromoléculas en la solución (un resultado de lisis de las bacterias). El paso determinante en esta técnica es la neutralización con el buffer de neutralización (P3) frío que contiene acetato de potasio (AcOK). El pH bajo de la solución del acetato del potasio neutraliza el NaOH. Cuando el pH se aproxima a la neutralidad comienzan a renaturalizarse las macromoléculas.  Sin embargo, el DNA genómico no renaturalizan correctamente. El DNA genómico forma enlaces hidrofóbicos, iónicos y puentes hidrógeno no específicos debido a que la conformación correcta de la molécula no fue mantenida durante la desnaturalización.  Mientras que las moléculas grandes de DNA genómico y las proteínas forman precipitados formando un agregado grande, los plásmidos no precipitan porque ellos renaturalizan correctamente quedando en solución. Luego de incubar durante 10` en el buffer de renaturalización (P3) en hielo, se realizó una centrifugación (15`-10000rpm). Se tomó el sobrenadante y se agregó isopropanol. Al agregar una concentración adecuada de isopropanol se disminuye la solubilidad del DNA.  Puesto que las moléculas de la DNA son iónicas, debido a los grupos fosfatos, son altamente solubles en agua pero no soluble en solventes orgánicos.  El isopropanol es de uso general precipitar ácidos nucleicos de soluciones acuosas. Luego se centrifugó (30`-14000rpm) y se descartó el sobrenadante.

El siguiente paso fue evaporar el alcohol utilizado en el paso de la precipitación.  El lavado con etanol (70%) con el objetivo de eliminar las sales y se centrifugó (5`-14000rpm). Se sacó el sobrenadante, se secó a 37ºC y luego se lo resuspendió en agua (pH 7).

Luego se realizó una electroforesis en gel de agarosa a fin de cuantificar el rendimiento de la purificación por comparación de la intensidad de fluorescencia con cantidades conocidas de DNA del fago lambda (λ).

Identificación de clones positivos por restricción.

Con el objetivo de verificar la presencia del inserto en las construcciones obtenidas, se realizó una digestión enzimática del DNA obtenido de la miniprep, con las mismas enzimas utilizadas anteriormente para obtener el gen de interés y subclonarlo en el vector. Estas digestiones se corrieron el un gel de agarosa y se observaron por exposición al UV.

Geles de proteínas e identificación de la proteína de fusión en geles nativos y desnaturalizantes.

Con el fin de identificar la proteína fusión se sometieron las muestras provenientes de la purificación de la GFP y de la elusión con glutation reducido a electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE (condiciones desnaturalizantes) y en gel nativo (condiciones no desnaturalizantes).

El propósito de los geles en condiciones desnaturalizantes es separar las proteínas según su tamaño, y ninguna otra característica física. El dodecil sulfato sódico (SDS) es un detergente aniónico que confiere a la superficie de las proteínas una densidad de carga uniformemente negativa, de manera que sus velocidades de migración a través del gel quedan fundamentalmente determinadas por sus pesos moleculares. Además es un agente desnaturalizante, por lo que produce que las proteínas migren por su tamaño y no por su forma.

Se utilizó un sistema de electroforesis discontinua el cual consiste en dos tipos de geles, uno concentrador o `stacking` (de poros grandes) y otro separador (de poros pequeños). Las concentraciones de poliacrilamida fueron de 10% y 5% para el `stacking` y separador respectivamente en el gel nativo; mientras que para el gel desnaturalizante fue de 8% y 5%.

Este sistema se fundamenta en que los constituyentes iónicos de las soluciones tampones utilizadas en ambos geles son iguales, pero el pH de éstas y el tampón de corrida empleado en los electrodos es diferente. La separación ocurre en el gel separador, donde la migración está determinada por la carga y el tamaño molecular de las partículas. Encima de este gel se sitúa el gel stacking, de menor longitud (1/3 del gel separador), en el que la muestra se concentra en una zona muy estrecha; lo que determina la separación en bandas finas en el gel separador y alto poder de resolución. El proceso general en SDS-PAGE discontinuo consta de 2 etapas: concentración y resolución. Se puede entonces determinar el peso molecular aparente de cualquier proteína por comparación con un patrón de proteínas de pesos moleculares conocidos. Las movilidades de las proteínas en los geles de SDS-PAGE son funciones lineales del logaritmo de su peso molecular. Para la visualizar todas las proteínas de este gel, se utilizó la tinción por Commasie Blue R-250. El segundo método consiste en someter a las muestras a una electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones no desnaturalizantes. La GFP en estado nativo emite fluorescencia al ser irradiada con UV (λ=245nm). Este mιtodo permitió identificar la proteína fusión por observación directa de la fluorescencia emitida.

Resultados

Digestión enzimática del plásmido pRibotex.

De la digestión enzimática del plásmido pRibotex, en el cual se encontraba clonado el gen de la GFP, con las enzimas HaeIII, HinfI y BamHI-HindIII , se observó el patrón de corrida que se muestra en la figura 1. En las misma se observa que las enzimas de alta frecuencia de corte liberaron 5 y 6 fragmentos respectivamente y ademas presentaron un chorreado correspondiente a fragmentos pequeños. Las combinación de enzimas de baja frecuencia de corte presento la liberación de dos fragmentos.

Figura 1 – Digestión enzimática del plásmido pRibotex-GFP con enzimas de alta frecuencia de corte y con una doble digestión. (MW= Marcador de peso molecular)

Síntesis de la sonda radioactiva por el método de PCR.

En la figura 2, se observan los resultados de las PCRs, resueltos en un gel de agarosa, en donde se revela como las diferentes variables afectan el rendimiento de la reacción.

En el control negativo (Calle 1 – Grupo 1) no se observó la banda esperada, pero se observa contaminación cuyo tamaño es característico de los plásmidos, ya que se presenta como tres bandas sucesivas. En las calles 2 a 6 se utilizaron cantidades crecientes de dNTP`s (0, 50, 100, 250 y 500uM). En la calle 2 no se observa el fragmento correspondiente a la GFP, lo que es esperable ante la ausencia de dNTP`s. En las calles siguientes se observa una intensidad creciente de las bandas, que indica que a mayor cantidad de dNTP`s mayor amplificación del fragmento.

Figura 2 – Corrida electroforética de los productos de PCR

A partir de los resultados de las PCR`s del resto de los grupos se determinaron las condiciones óptimas para la PCR.

Tabla 3 – Condiciones óptimas para la PCR.

*No se pudo sacar conclusiones ya que la unica calle que presenta banda es en la que supuestamente no se incluyó DNA.

Las Tm de los primers se calcularon a partir de la siguiente fórmula:

Tm = 2(A+T) +4(G+C) º C.

Datos: Secuencia de los primers

GFPs: Tm = 68 °C

5’-GGGATGAGTAAAGGAGAAGAACTT-3`

GFPa: Tm = 60 °C

5`-CATATGACTGGGTATCTCGC-3`

El programa de ciclado de PCR utilizado fue el siguiente:

95 º Cà Para desnaturalizar el DNA.5 min.

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95 º Cà Desnaturalización. 1 min.

55 º Cà Hibridación con primers. 30 seg. (35 ciclos.)

72 º Cà Extensión. 30 seg.

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72 º Cà Terminar extensión. 10 min.

Nótese que la hibridización se realiza a 55 º C mientras que los Tm de los primers son de 60 y 68 º C. Esto se debe a que se desea favorecer el `annealing` de los mismos con el molde.

Purificación de los fragmentos de ADN, a partir del gel de agarosa.

Con el objetivo de purificar el fragmento que contiene la GFP y purificar el vector de expresión pGEX-2T, se resolvieron las muestras (previamente digeridas con BamHI y EcoRI) en un gel de agarosa 1% (Figura 3).

Fig: 3. Digestión de pGEX-2T y gen de GFP resueltos en gel de agarosa, para la posterior purificación.

Se puede observar en la calle MW el marcador de peso molecular, en la calle 1 pGEX digerido, en la calle 2 el vector pGEX sin digerir. En la calle A vemos la digestión del vector pGEM-T-GFP digerido y por ultimo en la calle B vemos el vector pGEX digerido. Se ven en la calle A un fragmento de 3Kb aproximadamente y uno de 0.7Kb correspondiendo al vector pGEM-T y al fragmento que contiene el gen de la GFP respectivamente. En la calle B podemos ver una única banda de 5Kb correspondiente al vector pGEX linealizado.

Luego se purificó el vector pGEX y el fragmento correspondiente a la GFP, por el kit Quiaex II (adsorcion del DNA a una matriz de vidrio en medio ácido). Posteriormente se procedió a cuantificar la concentración obtenida luego de la purificación, la cuantificación se realizo en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, y se comparo con un marcador de peso molecular (λ DNA-Hind III) del cual contiene una concentraciσn de DNA de 500ug/ml. (Figura 4)

Fig.4. Cuantificación de DNA en gel de agarosa.

En las siembras de inserto (I2) se estimó una concentración de DNA de 5 ug/ul, la concentración de vector (V2) estimada fue de 2.5ug/ul. Mediante este método no fue cuantificable la concentración de DNA sembrada ya que la concentración del marker no fue la concentración descripta por el fabricante o la siembra fue mayor a 1ul. Se estimaron las concentraciones de DNA obtenidas luego de la purificación empíricamente a partir de la intensidad de fluorescencia de las bandas obtenidas.

Luego se realizó la ligación del fragmento de GFP en el vector pGEX, diseñando el protocolo de ligación de forma tal de tener una relación inserto vector de 1:1 y 3:1, para esto se utilizaron las concentraciones de DNA de la tabla X . También se largo una ligación con el plasmido pUC para calcular la eficiencia de transformación, para esto se transformaron bacterias E. coli competentes con 10ul de plasmido pUC (0.01ng/ul).

Tabla 4. reacciones de ligacion diseñadas para pGEX GFP.

Los resultados de las ligaciones fueron los siguientes, control vector sin ligasa sin inserto sin colonias.

Control inserto con ligasa, sin colonias.

Control vector con ligasa 1 colonia.

Productos de ligacion 1:1 7 colonias, 3:1 1 colonia.

Plasmido PUC, 5 colonias.

Luego se calculó la eficiencia de transformación (ET):

ET= UFC/ ug de DNA (super coil)

ET=5/(0.1 x 10-3ug)= 5 x104UFC/ug

La eficiencia de transformación obtenida es tres ordenes de magnitud menor que la esperada, lo cual se corresponde con el numero de colonias obtenidas por el grupo.

Tabla 5. Resultados obtenidos en los plaqueos luego de realizadas las transformaciones.

Purificación de ADN plasmídico, inducción de la expresión génica.

Luego de repicar las colonias obtenidas de la ligación en medio liquido, se dejaron crecer a 37º durante una noche, se repicaron cuatro colonias de las placas de ligación, y se realizo una miniprep mediante el protocolo antes descripto, luego de la purificación de ADN plasmidico se realizo un mapeo de restricción para verificar que los clones contengan el fragmento del gen de GFP, esta digestión se realizo con BamHI y EcoRI, los resultados fueron analizados por resolución en gel de agarosa (Fig 8.)

Figura 8.

Luego del mapeo de restricción, pueden observarse en el gel de agarosa que se obtuvieron dos bandas claras, una banda de 3Kb y una banda mas pequeña de 0.7Kb correspondientes al vector pGEX y al inserto de GFP respectivamente, por lo que se determino que los clones repicados fueron positivos, contenían el inserto correspondiente al fragmento de GFP.

Luego para verificar la presencia del gen de GFP y la actividad de la proteína se indujeron cultivos de crecidos toda una noche, se utilizo como inductor IPTG, se verifico actividad de GFP por fluorescencia al UV de los pellets bacterianos.

Procesado de los cultivos inducidos y purificación de proteínas recombinantes utilizando glutation agarosa.

Nuestro gen de interés (GFP) se encontraba clonado dentro de un vector de expresión (pGEX-2T) el cual permite la fusión con el gen que codifica para la proteína glutation-s-transferasa (GST). Esta proteína fusión tiene la capacidad de unirse específicamente a una resina que contenga glutation agarosa, pues la GST es una enzima que utiliza como sustrato el glutation. La sensibilidad de esta enzima es muy alta, lo cual permite que esta proteína fusión, pueda ser purificada en un solo paso en una columna de afinidad muy eficientemente.

Con el fin de lisar las bacterias, se resuspendieron los pellets congelados de las bacterias en 500ul de buffer conteniendo TBS y PMSF 1X y EDTA (inhibidores de proteasas). Luego se sometieron a pulsos de sonicado de 20 segundos. A fin de disolver las membranas bacterianas, se agregó Tritón X-100 y se incubó en hielo durante 10 minutos. Luego de centrifugar, se incubo el sobrenadante con la resina (glutation agarosa) hidratada con TBS. Se realizaron tres lavados con TBS y Tritón con el objetivo de eliminar otras proteínas y restos celulares.

Se eluyeron las muestras por dos métodos diferentes, por un lado se incubo la resina con una solución que contenía glutation reducido. El glutation reducido compite con la resina por el sitio activo de la enzima GST. Esto produce un desplazamiento del equilibrio químico, que genera la elusión de la proteína fusión. Por otro lado se incubo la resina con trombina (proteasa que corta en forma específica en una secuencia presente en la proteína de fusión) durante una hora con agitación (1 unidad de enzima).

Purificación de GFP e identificación de la proteína en geles nativos y desnaturalizantes.

Luego de la purificación de la proteína de fusión mediante glutation agarosa se clivo la fusión mediante la proteasa trombina. Una vez purificada la proteína se identifico mediante geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (Fig.9) y nativos (Fig.10).

Figura 5. Gel de poliacrilamida desnaturalizante (SDS-PAGE).

Figura 6. Gel nativo de poliacrilamida nativo.

En la calle 1 podemos observar el marcador de peso molecular, luego en la calle 2 se encuentra la muestra correspondiente a la incubación con trombina previo donde vemos un chorreado. En la calle tres se encuentra la muestra de elusión post corte incubado con glutation reducido, donde encontramos dos bandas y un chorreado de proteínas

Conclusiones

Se logró la transformación de E.coli y la expresión de la proteína GFP activa en este sistema. Las transformaciones realizadas y sus respectivos controles dieron resultados aceptables. Se apreció fluorescencia emitida en el gel de poliacrilamida nativo, lo cual indica que se pudo purificar la proteína recombinante con un buen rendimiento. La fusión a la proteína GST permitió esta eficaz purificación, gracias a la capacidad que tiene esta al unirse al glutation en la cromatografía de afinidad.

Se logró el aprendizaje técnicas básicas de genética molecular (tecnología de DNA recombinante) complementándolas con técnicas de Biología molecular.

Bibliografía

• Molecular Cell Biology. Lodish, Berk, Matsudaira. Fifth Edition. 2004.
• Genes VIII. Benjamin Lewin. Eighth Edition. 2004.
• Molecular Cloning Web.

Ayelen Rapoport

Juan Carlos Assen

Fabián A. Shalóm

Cátedra de GyBMD – Instituto de Inv. Biotecnologicas – Univ. Nac. de Gral. San Martín

Av. General Paz 5445, INTI, Edificio 24 , Prov. de Bs. As.

Agosto de 2007