Azospirillum spp coloniza la rizósfera de trigo (Triticum aestivum L) var Pavón y promueve su crecimiento (página 2)

3. Condiciones del crecimiento vegetal.

Se usó el sistema semihidropónico de jarras de Leonard con 4kg de suelo no estéril (5.3% de materia orgánica, 0.26% de nitrógeno, 11.1 % humedad y pH 7.4). El sistema fue alimentado con la solución nutritiva de White para plantas con la siguiente composición: K2HPO4 1M, 1ml KH2PO4 1M, 1ml; MgSO4x7H2O 1M, 1ml; CaCl2x2H2O 1M-1 ml; FeSO4 trazas; pH 7.0, agua destilada 1000 ml. La solución de elementos menores utilizada fue: ácido bórico, 2.6 g; ZnSO4x7H2O, 0.22 g; KCl, 0.09 g; NaMoO4, trazas; agua destilada, 100 ml por cada 1000 de la solución base mineral; pH 7.0 (23).

4. Inoculación de trigo con las PGPR.

Las especies de Azospirillum y A beijerinckii se crecieron en caldo nutritivo e incubaron en agitación a 250 rpm por 24 h a 30°C. Se centrifugaron a 3000 rpm/15 min, los paquetes celulares se lavaron dos veces con solución salina (NaCl 0.85%) y se ajustaron a una concentración de 3×1 03 UFC/ml; se tomó 1.0ml de cada suspensión bacteriana por semilla, excepto en aquellas inoculadas con la mezcla de las dos especies de Azospirillum (0.5 ml de cada una). Se sembraron cuatro semillas por jarra, cuando germinaron se dejaron dos y la superficie se cubrió con aserrín estéril. Se empleó un diseño experimental de seis tratamientos con cuatro repeticiones cada uno: a) trigo sin inocular y con 160 kg/ha de urea equivalente a la dosis 100% (control relativo); b) trigo inoculado con A. lipoferum y el equivalente al 50% de la dosis completa de urea: 80 kg/ha; c) trigo inoculado con A. brasilense y 80 kg/ha de urea; d) trigo inoculado con la mezcla de las dos especies de Azopirillum y 80 kg/ha de urea; e) trigo inoculado con Az. beijerinckii y 80 kg/ha de urea y f) trigo sin inocular, ni urea (control absoluto). Las jarras se mantuvieron en invernadero durante 15 y 30 días. La solución mineral para plantas se agregó además para mantener la humedad del suelo constante al 60% de la capacidad de campo. Las diferencias entre tratamientos se obtuvo por comparación de medias de Tukey (18).

5. Variables-respuesta consideradas.

h) del trigo completo (parte aérea y radical) inoculado con las PGPR y sin inocular: Además se midió la altura de la parte aérea, la longitud de la hoja y de la raíz (12).

6. Recuperación de A. brasilense.

De las raíces del trigo inoculado se intentó reaislar Abrasilense y A. lipoferum, las raíces se lavaron con agua corriente para eliminar el suelo, se desinfectaron superficialmente con alcohol al 96% por 15 min y luego con hipoclorito de sodio al1 0% por 5 min; se lavaron siete veces con agua destilada estéril, para triturarse en un mortero con solución salina estéril. Del macerado de raíz se tomó 0.1 ml para sembrar en MB y en ML, y se incubaron por cinco a diez días a 30°C (19).

Cuadro 1. Respuesta del trigo (Triticum aestivum L var Pavón)

a la inoculación con bacterias promotoras de crecimiento vegetal.

*Días después de la siembra. Todos los valores son el promedio de ocho plantas. Letras iguales no indican diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos según Tukey (O.OI).**equivalente a 160 kg/Ha.

Resultados y discusión

Los resultados del cuadro 1 muestran que la inoculación del trigo con las PGPR influyó positivamente en principio en la germinación de sus semillas y luego en las primeras etapas del desarrollo de su raíz y en general de la planta, como se reporta en otras gramíneas en las cuales sus productos de excreción radical se utilizan las PGPR, como fuente de carbono y energía para luego transformarse en SPCV (16-20). Como se sabe, estos compuestos aceleran la actividad radical para aumentar su capacidad de absorción de minerales, como el nitrógeno necesario para un crecimiento vigoroso, semejante al observado en el trigo inoculado y que fue similar al aspecto del trigo que se fertilizó sólo con la dosis 100% de urea. Pues está demostrado que el exceso de fertilizante nitrogenado de lo recomendado a un cultivo vegetal, inhibe la acción benéfica de las PGPR (23), además de causar contaminación ambiental.

En contraste con la absorción radical del nitrógeno del suelo por el trigo utilizado como control absoluto (sin inocular y sin urea) estadística mente semejante a la del trigo empleado como control relativo (sin inocular y la dosis 100% de urea). Se encontró una respuesta positiva del trigo inoculado con Azospiri11um en términos de peso seco, comparado con la del trigo usado como control relativo, lo que sugiere además que los patrones de conversión de los exudados radicales en SPCV pueden ser específicos para cada tipo PGPR 1(4,15), ya que Azospiri11um causó un impacto positivo sobre el peso seco de la raíz trigo (2,8,11) que Azotobacter no produjo (7,21). Esto sugiere que la respuesta del trigo a la inoculación con PGPR es dependiente de la gramínea y la PGPR involucrada (10).

Las especies de Azospiri11um indujeron una mejor respuesta del trigo a la absorción de urea, que aquel inoculado con Az. beijerinckii en esterilidad, lo que indica una interacción específica entre las raíces de la variedad Pavón y las especies de Azospiri11um utilizadas, las cuales aumentaron la eficiencia de absorción radical del trigo por la urea en parte por las SPCV que estimularon la proliferación de pelos radicales lo que amplió el área de exploración de la raíz y su capacidad de absorber el nitrógeno derivado de la urea (13,19). Este hecho no se detectó con Azotobacter a pesar de la ausencia de competencia por los exudados radicales del trigo (17) en el suelo esterilizado. Se observó un efecto positivo de las PGPR sobre la longitud de la hoja, que sugiere que las SPCV de Azospirillum influyen en ciertas etapas fisiológicas y partes de la planta (10). En tanto que la longitud de la raíz y su patrón de crecimiento mostraron un efecto hormonal (23), que se relacionó directamente con el incremento en el porcentaje en el peso fresco y seco de la planta completa, el cual supone que los exudado s radicales del trigo fueron convertidos en SPCV, como se reporta en experimentos de inoculación de PGPR en maíz, en trigo y en arroz en donde se redujo la dosis de fertilización nitrogenada utilizada para la producción de estas gramíneas (2).

Figura 1. Dinámica de colonización de la espennatósfera-rizósfera (ER) de trigo var Pavón por bacterias promotoras del crecimiento vegetal. Las PGPR se inocularon en semillas de trigo y se sembraron en un suelo agrícola no estéril, se registró el comportamiento de cada PGPR en la ER del trigo con un medio selectivo diseñado con ese propósito. Las plantas se mantuvieron en condiciones de invernadero por 30 días.

Figura 2. Supervivencia de especies de Azospirillum lipoferum y A. brasilense en suelo no esterilizado, sin raíces. Las PGPR fueron inoculadas en un suelo agrícola no estéril, sin raíces. La determinación de su sobrevivencía se realizó por recuento en placa con el uso de medios diseñados para la recuperación de cada especie de Azospirillum, para detalles ver texto.

La síntesis de SPCV por las PGPR se reforzó con un ensayo realizado en esterilidad, en el que semillas de trigo se trataron con extractos libres de células de Azospirillum y Azotobacter, en este caso se observó una rápida germinación de las semillas entre 2-3 días, en comparación con las semillas del trigo tratadas sólo con agua y que germinaron en 6 días como promedio (8). Esto confirma que la influencia positiva de las SPCV de Azospirillum se detecta desde la germinación de las semillas del trigo, la cual continúa en las primeras etapas del desarrollo radical, debido a la atracción que la zona ER ejerce sobre Azospirillum (6,15), de la misma manera Az. paspali interactúa y ejerce su actividad positiva sobre el crecimiento del sistema radical del pasto tropical. Paspalum notatum (12,16).

En la figura 1 se presenta la dinámica de la colonización de las raíces del trigo por las PGPR en la que no se observó diferencia en la forma en la cual estas bacterias ocuparon y dominaron esa zona del trigo, con un período de adaptación de tres días, inducido por la atracción de los exudados radicales liberados durante la germinación de las semillas este proceso fue acelerado por la utilización de los compuestos orgánicos de desecho radical como fuentes de carbono y energía, lo que se observó desde el tercer día hasta el sexto, en que las PGPR alcanzaron su máxima densidad celular, este hecho es necesario para que el trigo responda favorablemente a la inoculación con PGPR (l ,3).

Se recuperó A. brasilense del interior de las raíces del trigo, ello sugiere que posee un mecanismo para alcanzar esa zona del trigo (11) lo que indica que está especie de PGPR esta adaptada tanto a la utilización de los exudados de la raíz, como a las sustancias que existen en su interior (2,5) y que A. brasilense es bioquímicamente atraído por los productos orgánicos de carbono existentes exclusivamente en el interior del sistema radical (9), ésta característica nutricional, única en A. brasilense, se comprobó cuando se le inoculó en el suelo no esterilizado sin raíces, en donde no sobrevivió más de tres días, como se muestra en la figura 2. Este hecho, aunado a la competencia y depredación de los microorganismos nativos de ese ambiente contra las especies de Azospirillum impidieron su supervivencia, lo que reafirma su condición como una especie exclusiva de la rizósfera tanto en su exterior como en su interior (15). A. lipoferum fue viable el doble del tiempo, probablemente por su capacidad para utilizar lentamente su reserva energética, lo que prolongó su persistencia en el suelo no estéril como se reporta para ciertas PGPR en ausencia de raíces vegetales (9).

Estos resultados sugieren que la investigación sobre el tipo de exudados radicales atrayentes para las PGPR y que posteriormente se convierten en SPCV son aspectos clave para un pronóstico de respuesta positiva del trigo a la inoculación con este tipo de rizobacterias, que incluye la reducción de la dosis de fertilización nitrogenada aplicada al cultivo; con ello se evita el deterioro del suelo así como la contaminación de las aguas superficiales y subterráneas (18).

Agradecimientos. A la Agencia Internacional de Energía Atómica de la FAO-UN, Viena, Austria. Research contract No MEX 302-DI-MEX-7944, a la CIC de la UMSNH por el proyecto 2.7 (2005-2006), a Beatriz Noriega-Gamboa por la escritura y corrección de este trabajo.

Dedicatoria a Verónica, Maria del Consuelo, Raúl, Sandra Luz y Mercedes Sánchez Y, por su cariño y apoyo de siempre.

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1García G. M.M.,

1+Leal L L.,

2Carillo A, JC

2Sánchez-Yáñez. J. M*

1Microbiologia del del suelo, +Educación ambiental. Facultad de Ciencias Biológicas Universidad Autónoma de Nuevo León, Monterrey, N.L. México; 2Microbiología Ambiental

*autor correspondiente

Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Morelia, Mich. México.