Como control se plaquearon las bacterias utilizadas inicialmente con el mismo medio con antibióticos utilizados para la selección.
Mutagénesis por transposición
A partir de un cultivo silvestre de A. tumefaciens, cepa A348 resistente a Cloramfenicol, se realizó una conjugación biparental con la cepa de E. Coli S17λpir, la cual porta el vector suicida pUTminiTn5Km. Al no poder replicarse autσnomamente excepto en presencia del gen pir, este vector no puede replicarse en A. tumefaciens por lo que se pierde en las sucesivas divisiones de la bacteria.
Aunque el vector que porta el transposón miniTn5 se pierde, el evento de transposición se efectúa antes de que esto ocurra, y se puede evidenciar ya que este transposón posee un gen que le confiere resistencia a la Kanamicina.
Para la realización de la conjugación biparental se partió de dos cultivos en medio líquido de S17λpir(pUTKm) y A348. Se tomσ una alícuota de 500 ul del cultivo de S17λpir(pUTKm) y se centrνfugo eliminando posteriormente el sobrenadante. Al pellet obtenido se le agregó 500 ul del cultivo de A348, y se procedió a centrifugar nuevamente con la posterior eliminación del sobrenadante. A este pellet ahora proveniente de los dos cultivos, se le realizó un lavado con LB. Esto se realiza con el fin de eliminar los antibióticos presentes en los distintos medios de cultivo. Luego se volvió a centrifugar, se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el pellet en 25 ul de LB.
Posteriormente se tomó el material resuspendido y se lo colocó en el centro de una placa conteniendo LB. Se incubó a 28 °C toda la noche. Se levanto el botón y se resuspendió suavemente en 250 m l de LB. Luego se tomaron 100 m l de la resuspensión y se la coloco con 900 m l de LB. Se plaqueó la resuspensión y la dilución.
A modo de seleccionar aquellas A. tumefaciens que incorporaron el transposón, se realizó un plaqueo en medio LB con los antibióticos Kanamicina y Cloramfenicol. Se utilizó calcofluor 0,2%, con el fin de visualizar si el evento de transposición ocurrió sobre el gen pgm al exponer las placas bajo luz UV.
Transformación
A partir de un cultivo de células competentes de Escherichia coli, se realizó una transformación con un plásmido recombinante, el cual porta la resistencia para el antibiótico Ampicilina.
Se tomaron 100 ul de las células competentes y se agregó 2 ul de plásmido. Se dejó reposar 30 minutos en hielo y luego se aplicó un baño de agua a 42 °C durante 40 minutos con el fin de favorecer la transformación. Una vez terminado el baño, se mantuvo en hielo durante 2 minutos, para luego diluir la muestra en 900 ul de LB.
Luego se dejó a 37 °C durante 1 h y se plaqueó 100 ul de la dilución en medio LB con el antibiótico Ampicilina.
RESULTADOS y DISCUSIONES:
Complementación funcional
Los controles realizados para la complementación arrojaron resultados esperados, no encontrándose crecimiento bacteriano.
En la placa que contenía medio LB con los antibióticos Kanamicina y Tetraciclina y calcofluor al 2%, se observó crecimiento.
Esto indica que el evento de conjugación fue exitoso. Se observaron las colonias bajo luz UV, encontrándose bacterias con fenotipo Bright. Esto revela una complementación funcional satifactoria del gen pgm. Tambien se visualizaron colonias con fenotipo Dark. Esto puede ser debido a una posible contaminación de las placas.
En los controles de la comisión A se encontraron colonias de E. coli, por lo que se supone que ésta es la cepa contaminante encontrada en las placas de la comisión B.
Mutagénesis por transposición
No se observó crecimeinto bacteriano en las placas de control. En la placa utilizada para seleccionar aquellas A. tumefaciens que incorporaron el transposón, se observó crecimiento. Se utilizó calcofluor 0,2%, con el fin de visualizar si el evento de transposición ocurrió sobre el gen pgm.
Bajo la luz UV se observaron colonias de fenotipo Brigth exceptuando una sola que mostó un fenotipo Dark. Este resultado no garantiza que el transposón haya caído en la secuencia del gen pgm. Para confirmar esta mutación deberían realizarse pruebas como PCR, FISH o Southern Blotting.
Transformación
Se pudo observar crecimiento en las 2 comisiones. En la placa de la comisión A se encontraron cepas aisladas mientras que en la de la comisión B se visualizaron colonias en forma de césped. Esto puede deberse a que las bacterias utilizadas en ambas comisiones poseían diferentes eficiencias en cuanto a la competencia, siendo las B mas competentes. En ambos casos se utilizó la misma cantidad de DNA plasmidico
Al no poder observarse colonias aisladas en las placas de la comisión B los cálculos necesarios para obtener la eficiencia de la transformación fueron obtenidos a partir de las placas de la comisión A. Para ello se utilizó la siguiente ecuación, en donde se debe tener en cuenta la cantidad de ADN utilizado y si se realizó alguna dilución:
Como estas 240 UFC fueron encontradas en una dilución de 1 en 10, para encontrar la eficiencia real debe multiplicarse el valor encontrado por el factor de dilución. Dicho valor se expresa a continuación
BIBLIOGRAFÍA:
Prescott L.M., Harley J.P. y Klein D.A. (2003) Microbiología – 4ta Edición – ISBN:84-486-0261-7
Olivera Ramiro,
Pitkowski Martín
Shalóm Fabián
Cátedra de Microbiología – Escuela de Ciencia y Tecnología – Universidad Nac. De San Martín
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