Genética bacteriana
Enviado por Fabián Shalóm
OBJETIVOS:
- Generar cambios genotípicos en bacterias por medio de:
- complementación funcional
- mutagénesis por transposición
- Transformar con un plásmido recombinante células competentes de E.coli
PROCEDIMIENTO:
Complementación funcional
Se realizó una complementación funcional por conjugación triparental a una mutante pgm de Agrobacterium tumefaciens, la cual carece de la enzima fosfoglucomutasa. Al ser incapaz de transformar Glu-6-P en Glu-1-P, no puede sintetizar polisacáridos estructurales y de reserva que contengan glucosa. La falta del exopolisacárido en estas mutantes se evidencia al iluminar con UV placas conteniendo calcofluor, observándose un fenotipo Dark.
En cambio, la interacción del calcofluor con el EPS en las cepas salvajes, muestra un fenotipo Bright en presencia de UV.
Como bacteria donadora se utilizó un cultivo de Escherichia coli CL4 el cual era resistente al antibiótico Tetraciclina y contenía el plásmido no conjugativo, movilizable, que llevaba la secuencia completa del gen pgm de A. tumefaciens. Como este plásmido carece de los genes tra, necesarios para transferencia conjugativa, fue necesaria la utilización de una cepa Helper 2013, la cual era resistente al antibiótico Kanamicina. Este cultivo posee los genes tra necesarios para la transferencia conjugativa.
Con estas tres cepas se realizó un plaqueo en medio LB sin antibióticos, reuniendolas en un mismo inóculo para favorecer el evento de conjugación. Se las incubó a 28 °C por una noche (‘over-night’).
A modo de poder seleccionar a las mutantes de pgm de A. tumefaciens
que recibieron el plásmido con el gen pgm, se utilizó un medio LB con los antibióticos Kanamicina y Tetraciclina. Para poder visualizar el fenotipo se utilizó calcofluor al 2%.
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