La ingeniería genética

Enviado por Ing.+ Licdo. Yunior Andrés Castillo Silverio

RESUMEN:

En este trabajo se nos ha encargado el análisis de una secuencia de 17000pb de un microorganismo desconocido. Mediante el Programa informático Artemis se obtuvieron los ORFs que codificaban paras las distintas proteínas y de esta manera se eligió una de ellas para realizar un estudio más concreto de su función, estructura, etc. mediante diversos programas informáticos

INTRODUCCIÓN

El género Rhodococcus pertenece a un grupo de microorganismos aerobios de alto contenido en G+C . Son bacterias Gram posisitivas, no esporuladas que se han encontrado ampliamente distribuidos en el medio ambiente y sobre todo en suelos, reservorios de aguas, ríos, lagos y otros ambientes acuáticos. Se ha encontrado que este grupo de bacterias está relacionado con Mycobacterium, Corynebacterium,Nocardia y Gordonia.

En cuanto a su clasificación taxonómica:

–Clase Actinobacteria

-Subclase Actinobacteridae

-Orden Actinomycetales

-Suborden Corynebarterineae,

–Familia Nocardiaceae

–Género Rhodococcus.

ANÁLISIS DE INFORMÁTICOS DE LA SECUENCIA MEDIANTE EL PROGRAMA ARTEMIS

Analizando la secuencia de 17000 pb mediante el programa informático Artemis se obtuvieron los distintos ORFs que codificaban para las distintas proteínas de la bacteria.

edu.red

Fig.1.Obtención de los ORFs de la secuencia mediante el programa Artemio.

De esta manera elegimos la proteína Lysyl-tRNA synthetase. La secuencia de esta proteína es la siguiente:

atgcctccatcttcctccttggccccaaacgggccatcgacgcctcacactggactcggagagacgacagtcactggaaggacctcgatggccacgagtaccggtagccctgtggacaccacggacaggcgggaccaccaccagacccgggtgacgccgaaacgcgggcggctgtcggaggttccgcacatcgcgggcctcgtcctcggcgtcttctcggtgctggtgttcctgtggagcctgtcgcccgcgctgcgctacctggtgcacacgccgcgcctgtacatcgacgactactacttcgacgcccccgacacgagcctgtcgtgggccgtcgtggtcggtctggtggcggccgcactcgcgagccgcaaacggatcgcgtggtggttgctgacgatctacctgaccctcttcgcagttctcaacgcggtcaccgcggtggcggacgagaacgtcaacgccgccgtcgcgtgcgtcgtgcagctcgcggtcgtcgggatcctgatcgcggcccgcaaggagttctacacgcgggtccgccgcggcgccgcgtggaaggcattgggcgtcctcgtgtccggcctggcggtgggcaccctgctgggctgggggctggtggagctgttcccgggcacgctgccgtcgggtcagcggttcctgtgggccctcaaccgcgtcaccgccctcgtcgtggtcgagaacgaacagttcgacggccacccccacgtcttcgtcaacaccctgctgggactgttcggggcgctcgccctgctcgcggcggtgatcacgctgttccgctcgcagcgggcgtcgaacgcgctgaccggcgacgacgaatcggcgttgcgcggcctgctcgacagcttcggtgccgacgactccctgggctacttcgcgacccgccgcgacaaggccgtcgtcttcgctccgagcggcaaggccgccgtcacctaccgcgtggagatcggcgtgtgcctggccagcggcgacccgatcggcaacccggaggcgtggccgcacgcgatcgacgcgtggctcgccctgtgctccaagtacggctgggcgcccgccgtgatgggagcgagcgaggccggcgccaccgcgtacaagcgggccggtctgtcggtgctccagctcggcgacgaggcgatcctcgaaacccgggagttcaatctgaacggccgcgagatgcggcaggtccgccaggccgtgcaccgggtccggaagcagggcgtcaccgtccgcatccgacgccaccgcgacatcccgcccgccgagatggccgacgtcgtcgcgcgtgcagatgcgtggcgcgacaccgagaccgagcgcggcttctcgatggccctgggccggctcggcgatcccctcgacggcgactgcctcctggtcgaggcgctcggcgaggacggcacggtgctgggcatgctgtcgctggtgccgtggggtccgaacggcgcatcgctcgacctgatgcgccggaacccggacgcccccaacggtgtagtcgaactgatggtcaccgaactcgcgacccgttccgacgagttcggcgtcgtgcgggtgtcgctcaacttcgcggtgttccgctccacgttcgaggagggcgcgcgcatcggcgccggtccgatcctgcgggtctggcggtcgatgctgctgttcttctcccggtggtggcagctcgaggctctgtaccgctcgaacgtcaagtaccagcccgaatgggcgccgcggtacctgtgcttcgacgacaaccggcagctgccgcgcgtcggaatcgcgtcggcgatcgccgagggtttcctgacgttgcccacgttcgggcaccgggcgaaggcgcccacgcacaccgggacccgcgccgcggtgccggcggcgctcgccgtctccggtgtcctgcacgcggacggcagtgcgcccgacgccgccgctccggcggccgacgcgcccacgggcaggacggacgggacggccccggaatcggtgggaccgcgccggcccgaacaggttcgcgtgcgcatggacaaactcgcccgcctggccgacgagggcatcgatccgtaccccgtcgcctacccgcccacccacaccgtcgccgccgcgacgtcgtccccggagggcacccgcgtgcgaatcgcggggcgcctgttgcggatccgcacgtacggcggcgtcgcgttcgcggtgctgcgggactggtccggcgacatccaggtgctcatcgaacgcaccacggtcggcgaccggctcgacgagttctccaccgacttcgacctcggcgacctcatggaggtgagcggcaccatcggccgcagccgcaagggtgaactgtcgctgctggcgacggagtggcgcatgaacggcaaatgcctgcaccccctgcccgacaagtggaagggcttgacggacgcggaaactcgcgtgcggcagcgttacgtcgacctcgcgatcaaccccgagtcgcggcggctgctggcggcgcgtaccgcgatcgtgaagtcgctgcgcgacaccctcgccggccgcgactacctcgaggtggagacgccgatcctgcagcgtatccacggcggcgccaacgcggcccccttcgtcacccatatcaatgcgtacgacctggacctgtacctgcggatcgcaccggagttgttcctcaaacgtctgtgtgtggccggtatggagaaggtgttcgagatcgggcgggtgttccgcaacgagggcgtcgacttcaagcacaacccggagttcacgatcctcgaggcgtacgaggcccacagcgactacgaacgcatgatggtgctgtgccgcgagctgatccaggccgcggccgtcgccgcacacggcagccagacgatcatgcgtcccggcccggacggcgaactcgtcgccgtcgacatctccggcgaatggcccgtgaagacgatgcacggcgcggtcgccgagaaactgggcgtggacgtcagcccggagacacccctcgaggtgctgcagaagttgtgcgacgagaacgacatcgagtaccagaagagctgggacgcaggcgcggtcgcgcaggagatgtacgagcatctggtggagggtcagaccgagttccccaccttctacaccaacttcccgacgtcgatgtcgccgctgacccgcccccaccccaccatccccggtgtggccgcgaagtgggatctggtggcgtggggcgtcgaactcggcaccgcgtacagcgaactcaccgatcccatcgaccagcgacgacggctcaccgagcagtcgctgctcgcggccggcggcgacgcggaggcgatggaactcgacgaggacttcctgcaggcgctcgagcacgcgatgccgcccaccggcgggctcggtatgggcgtcgaccggatcgtcatgctcatcaccggcggcagcatccgcgaatcgctggcgttcccgttcgccaagccgcgcaactga

La lisil-tRNA sintetasa es una proteína específica que cataliza la primera reacción que sufren los aminoácidos para intervenir en la biosíntesis de proteínas que es la unión al tRNA, en este caso, a la lisina. Por tanto se trata de una proteína importante para la síntesis de proteínas en Rhodococcus.

ESTUDIO DE LA PROTEÍNA

Mediante diversos programas informáticos se analizaron distintos aspectos de la proteína.

1. SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS MEDIANTE EL PROGRAMA EXPASY:

M P P S S S L A P N G P S T P H T G L G E T T V T G R T S M A T S T G S P V D T T D R R D H H Q T R V T P K R G R L S E V P H I A G L V L G V F S V L V F L W S L S P A L R Y L V H T P R L Y I D D Y Y F D A P D T S L S W A V V V G L V A A A L A S R K R I A W W L L T I Y L T L F A V L N A V T A V A D E N V N A A V A C V V Q L A V V G I L I A A R K E F Y T R V R R G A A W K A L G V L V S G L A V G T L L G W G L V E L F P G T L P S G Q R F L W A L N R V T A L V V V E N E Q F D G H P H V F V N T L L G L F G A L A L L A A V I T L F R S Q R A S N A L T G D D E S A L R G L L D S F G A D D S L G Y F A T R R D K A V V F A P S G K A A V T Y R V E I G V C L A S G D P I G N P E A W P H A I D A W L A L C S K Y G W A P A V M G A S E A G A T A Y K R A G L S V L Q L G D E A I L E T R E F N L N G R E M R Q V R Q A V H R V R K Q G V T V R I R R H R D I P P A E M A D V V A R A D A W R D T E T E R G F S M A L G R L G D P L D G D C L L V E A L G E D G T V L G M L S L V P W G P N G A S L D L M R R N P D A P N G V V E L M V T E L A T R S D E F G V V R V S L N F A V F R S T F E E G A R I G A G P I L R V W R S M L L F F S R W W Q L E A L Y R S N V K Y Q P E W A P R Y L C F D D N R Q L P R V G I A S A I A E G F L T L P T F G H R A K A P T H T G T R A A V P A A L A V S G V L H A D G S A P D A A A P A A D A P T G R T D G T A P E S V G P R R P E Q V R V R M D K L A R L A D E G I D P Y P V A Y P P T H T V A A A T S S P E G T R V R I A G R L L R I R T Y G G V A F A V L R D W S G D I Q V L I E R T T V G D R L D E F S T D F D L G D L M E V S G T I G R S R K G E L S L L A T E W R M N G K C L H P L P D K W K G L T D A E T R V R Q R Y V D L A I N P E S R R L L A A R T A I V K S L R D T L A G R D Y L E V E T P I L Q R I H G G A N A A P F V T H I N A Y D L D L Y L R I A P E L F L K R L C V A G M E K V F E I G R V F R N E G V D F K H N P E F T I L E A Y E A H S D Y E R M M V L C R E L I Q A A A V A A H G S Q T I M R P G P D G E L V A V D I S G E W P V K T M H G A V A E K L G V D V S P E T P L E V L Q K L C D E N D I E Y Q K S W D A G A V A Q E M Y E H L V E G Q T E F P T F Y T N F P T S M S P L T R P H P T I P G V A A K W D L V A W G V E L G T A Y S E L T D P I D Q R R R L T E Q S L L A A G G D A E A M E L D E D F L Q A L E H A M P P T G G L G M G V D R I V M L I T G G S I R E S L A F P F A K P R N Stop

2. TEMPERATURA DE ANILLAMIENTO

Temperatura = 93ºC

3. CONTENIDO EN G+C

El contenido en G+C de la proteína es de 70%

4. PESO MOLECULAR

El peso molecular de la proteína es de 1065,126Kd

5. HIDROFOBICIDAD

Using the scale Hphob. / Kyte & Doolittle, the individual values for the 20 amino acids are:

Ala: 1.800 Arg: -4.500 Asn: -3.500 Asp: -3.500 Cys: 2.500 Gln: -3.500

Glu: -3.500 Gly: -0.400 His: -3.200 Ile: 4.500 Leu: 3.800 Lys: -3.900

Met: 1.900 Phe: 2.800 Pro: -1.600 Ser: -0.800 Thr: -0.700 Trp: -0.900

Tyr: -1.300 Val: 4.200 : -3.500 : -3.500 : -0.490

Weights for window positions 1,..,9, using linear weight variation model:

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

edge center edge

MIN: -3.456

MAX: 3.133

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Fig. 2. Gráfica que representa la hidrofobicidad

6. DOMINIOS TRANSMEMBRANA:

# Sequence Length: 1150

# Sequence Number of predicted TMHs: 5

# Sequence Exp number of AAs in TMHs: 139.22254

# Sequence Exp number, first 60 AAs: 0.46269

# Sequence Total prob of N-in: 0.74927

Sequence TMHMM2.0 inside 1 62

Sequence TMHMM2.0 TMhelix 63 85

Sequence TMHMM2.0 outside 86 99

Sequence TMHMM2.0 TMhelix 100 122

Sequence TMHMM2.0 inside 123 126

Sequence TMHMM2.0 TMhelix 127 149

Sequence TMHMM2.0 outside 150 152

Sequence TMHMM2.0 TMhelix 153 172

Sequence TMHMM2.0 inside 173 184

Sequence TMHMM2.0 TMhelix 185 207

Sequence TMHMM2.0 outside 208 1150

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Fig. 3. Dominios transmembrana de la proteína lisil-tRNA sintetasa.

Según esto podemos decir que la proteína tiene varios dominios transmembrana pero que la mayor parte de ella es extracelular.

7. FILOGENIA DE LA PROTEÍNA:

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8. ESTRUCTURA DE LA PROTEÍNA:

edu.red

DISEÑO DE PRIMERS PARA LA AMPLIFICACIÓN DEL GEN POR PCR

PRIMER 1: GAATTC atgcctccatcttcctccttg Tm=60ºC

PRIMER 2: GAATTCtca gttgcgcggcttggcg Tm63ºC

El sitio de corte usado para amplificar fue EcoRI

DISEÑO DE PRIMERS PARA AMPLIFICAR FRAGMENTOS INTERNOS DEL GEN Y COMPROBAR SI DICHO GEN ES ESENCIAL O NO PARA EL ORGANISMO

Mediante el programa informático ClustalW2 se realizó el alineamiento de la proteína junto con la de otros cuatro microorganismos. Lo que se obtuvo haciendo esto fue lo siguiente: