Microscopio óptico – Contraste de fase
Células HeLa (Henrietta Lacks) Eritrocitos Humanos Zygnema Filamentous Algae Microscopio óptico – Contraste de fase
Microscopio óptico – Interferencia Permite la visualización detallada sin teñir
Maximiza la diferencia entre los índices de refracción entre las partes de la muestra de forma de hacer visibles los limites celulares Mismo principio que el microscopio de contraste de fase pero utiliza luz polarizada
Microscopio óptico – Contraste de fase e interferencia Contraste de fase Interferencia diferencial
Los objetos pueden también visualizarse por la luz que ellos mismos emiten Microscopio óptico – Fluorescencia (Gp:) Restringe infrarrojo (Gp:) Pasa sólo la ? que permite la excitación del fluorocromo
Aequoria victoria Microscopio óptico – Fluorescencia Algunos “objetos” fluorescentes… GFP (Green fluorescent protein)
(Gp:) hela
(Gp:) Drpspphila
(Gp:) Célula de cebolla (peroxisomas)
Microscopio óptico – Fluorescencia – Confocal
Microscopio óptico – Fluorescencia – Confocal
Microscopio óptico – Fluorescencia – Confocal
Microscopía electrónica – Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
Bacilos en división Mitocondria 60.000x Herpes virus ensamblándose en el núcleo Bacteria fagocitada por un macrófago Microscopía electrónica – Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
Microscopía electrónica – Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Glomérulo renal 1200x Célula en corte transversal Piel humana Espermatozoides bovinos Microscopía electrónica – Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Célula vegetal con cristales (falsa tinción) Bacterias sobre un estoma Glób. Rojo Glób. Blanco Microscopía electrónica – Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Elevados costos de los equipos y una infraestructura adecuada no permiten el uso de la técnica en cualquier laboratorio. Altos costos de procesamiento de las muestras La manipulación de reactivos se torna peligroso por la elevada condición toxica de los mismos. Procesamiento tedioso de la muestra. Creación de artefactos La complejidad de los equipos requiere de personal técnico especializado. Proporciona resultados de amplia resolución y magnificación Microscopía electrónica – Ventajas y desventajas
Técnicas inmunológicas
ELISA Western blot Inmunohistoquímica Inmunofluorescencia Citometría de flujo Técnicas inmunológicas Introducción a las Técnicas inmunológicas
Técnicas inmunológicas – Inmunoglobulinas
Anticuerpo Antígeno Técnicas inmunológicas – Anticuerpos epitope Linfocito B Activación
Antígeno Técnicas inmunológicas – Anticuerpos Epitope A Epitope C Epitope B
Técnicas inmunológicas – Anticuerpos policlonales Antigeno Activación Linfocitos B
Técnicas inmunológicas – Anticuerpos policlonales Suero (Gp:) Centrifugación
Sangre (Gp:) Purificación
Técnicas inmunológicas – Anticuerpos policlonales
Técnicas inmunológicas – Anticuerpos monoclonales Antígeno Purificación de Linfocitos B Sangrado Cultivo de células tumorales + Fusión Hibridoma
Hibridomas Screening: Búsqueda de hibridoma positivo y aislamiento Purificación de anticuerpos monoclonales del sobrenadante de cultivo de los hibridomas Técnicas inmunológicas – Anticuerpos monoclonales
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Para detectar Antígenos Anticuerpos
ELISA ELISA Para detectar Anticuerpos
Sensibilización Bloqueo Incubación con Suero
ELISA ELISA Para detectar Anticuerpos
Lavado Anticuerpo 2º Revelado
ELISA ELISA Para detectar Antígenos
Sensibilización Bloqueo Incubación con Suero
ELISA ELISA Para detectar Antígenos
Lavado Anticuerpo 2º Revelado
ELISA
Técnicas inmunológicas – Detección indirecta
(Gp:) Biotina (Gp:) Avidina
Técnicas inmunológicas – Complejo avidina/biotina
Antígeno Ac. primario Ac. secundario Biotina Cromógeno Cromóforo Avidina Peroxidasa Técnicas inmunológicas – Detección indirecta
Western blot Western blot
Transferencia SDS PAGE Gel Membrana
Western blot Bloqueo Anticuerpo 1º Anticuerpo 2º biotinilado Avidina-peroxidasa Revelado Sustrato coloreado que precipita al reaccinar Sustrato que emite luz al reaccionar con la enzima
Inmunohistoquímica Trozo de tejido Se corta en secciones muy finas y se coloca en un portaobjetos Anticuerpo 1º Anticuerpo 2º biotinilado Avidina-peroxidasa Revelado
Inmunohistoquímica – Sustratos
Inmunohistoquímica – Revelado Anti MMP-13 revelado con DAB Contratinción hematoxilina
(Gp:) Rodamina
(Gp:) Fluoresceina
(Gp:) Ficoeritrina
(Gp:) DAPI
(Gp:) Bromuro de Etidio
(Gp:) Naranja de Acridina
Inmunofluorescencia
(Gp:) N-myc/CD56
Rat neurons Inmunofluorescencia
Inmunofluorescencia – colocalización La colocalización permite determinar si dos antígenos se encuentran en el mismo lugar (nucleo, vacuola, retículo, etc) dentro de una célula
Inmunofluorescencia – colocalización
Citometría de Flujo Citometría de Flujo Célula Medida En movimiento Medida de las propiedades de las células mientras están en un flujo de líquido Inmunofenotipificación Viabilidad/apoptosis/Proliferación Ciclo celular Cambios en la superficie Actividad enzimática
Citometría de Flujo Mezcla de células Marcación con anticuerpos monoclonales
Citometría de Flujo La presión ejercida por una columna de fluido obliga a las células a “enfilarse” de a una
Citometría de Flujo Columna de células
Citometría de Flujo Laser Detector
Citometría de Flujo Tamaño Granularidad La luz que se detecta en la misma dirección del laser (forward) es detectada por el canal Forward Scatter Channel (FSC). La intensidad de la señal detectada se relaciona con el tamaño, y el indice de refracción de las células La luz que se detecta a 90 grados del haz del laser (side) es detectada por el canal Side Scatter Channel (SSC) La intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de estructuras citosólicas en la célula (gránulos, inclusiones, etc)
Citometría de Flujo Dado que FSC es proporcional al tamaño y SSC a las estructuras internas, una correlación entre ellos permiten la diferenciación de los distintos tipos celulares en una población celular heterogenea (Gp:) FSC (Gp:) SSC
Linfocitos (Gp:) Monocitos
(Gp:) Granulocitos
RBCs, debris, Células muertas
Citometría de Flujo – Histograma Intensidad de fluorescencia Cuentas
Citometría de Flujo – Dot Plot FL1 FL2
Citometría de Flujo – Dot Plot
Citometría de Flujo – Cell sorting
Citometría de Flujo
Citometría de Flujo
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