Evaluación del crecimiento celular y consumo de sustrato a partir del establecimento de suspensiones celulares de borojoa patinoi cuatrec (página 2)

1. Metodología

2. 1.1 Establecimiento in vitro de los explantes

   La desinfección de la semilla y la obtención de plántulas in vitro se realizó siguiendo el protocolo reportado por Martínez et al 2006. Una vez obtenidas las plántulas in vitro, se tomaron las hojas como explante para la inducción de callos friables, éstas se sembraron bajo condiciones estériles siguiendo el protocolo reportado por Martínez et al 2006 con modificaciones en la concentración de Sacarosa a 30 g/L y duplicando la concentración de vitaminas del medio Murashige Skoog 1962. El subcultivo de los callos a medio fresco fue llevado a cabo cada cuatro semanas. Los callos fueron mantenidos a condiciones de luz total y una temperatura promedio de 28°C.

   1.2 Establecimiento de las suspensiones celulares

   1.2.1 Desagregación celular

   Para determinar el tiempo de desagregación celular se empleó el medio líquido Murashige Skoog (MS) (1962) con la misma composición que fue usado para la obtención de callos friables con la adición de Ampicilina de grado reactivo a una concentración de 100 mg/L, el pH inicial fue de 5.8, la concentración inicial del inóculo fue de 20 gr Base Húmeda/L, con agitación orbital de 160 rpm y condiciones de luz total. Los callos utilizados en este ensayo tenían 8 semanas de edad. El muestreo se realizó por vaciado en tubos de centrífuga estériles y el monitoreo del crecimiento celular se realizó por el método de peso fresco y peso seco reportado por Habeych 2003.

   0. El desagregado celular se pasó a través de un tamiz en condiciones estériles. Se tomó una parte de éste por cada tres partes de medio fresco según lo reporta Roca et al. (1993).

   1. Establecimiento de las suspensiones celulares
   2. Análisis Estadístico

El efecto de los diferentes tratamientos se analizó estadísticamente mediante análisis de Varianza (ANOVA) y análisis de contraste de rangos múltiples con un 95% de confianza, utilizando el programa STATGRAPHICS Plus para Windows Versión 5.0.

1.2.4 Cinética de crecimiento de las suspensiones celulares

La cinética de crecimiento se evaluó en el medio de cultivo MS suplementado con sacarosa (30 g/L), Ampicilina (100 mg/L) y 2,4-D de acuerdo con el diseño de experimentos. El crecimiento celular se monitoreó mediante el método de peso fresco y peso seco de las células, descrito por Habeych (2003). Los tratamientos se realizaron por duplicado y el muestreo se realizó por triplicado, el sobrenadante obtenido se almacenó a -4°C y posteriormente fue empleado para la cuantificación de proteína total extracelular por el método de Lowry, para la cuantificación de azúcares reductores por el método DNS, para cuantificación de azúcares no reductores por el método DNS con hidrólisis ácida y para la determinación de metabolitos secundarios extracelulares por cromatografía de capa fina.

2. Resultados y Discusión

2.1 Establecimiento in vitro de los explantes

Se logró establecer el cultivo de callos friables in Vitro utilizando hojas provenientes de las plántulas mediante el protocolo reportado por Martínez et al. (2006), con modificaciones en la cantidad de sacarosa y vitaminas. A partir del día 8 y hasta los 20 días de cultivo, se comenzó a observar la presencia y formación de callos friables bajo condiciones de luz permanente. Esta modificación en el protocolo duplicó la velocidad de formación de los callos con respecto a la velocidad reportada por Martínez et al. (2006).

2.2 Establecimiento de las suspensiones celulares

El tiempo de desagregación celular a las condiciones evaluadas para B. patinoi fue de 6 días, esto se determinó cuantitativamente mediante una cinética de crecimiento y cualitativamente mediante la observación de las suspensiones Foto 1.

a – b

Foto 1 Aspecto de las suspensiones al inicio (a) y al final de la desagregación celular (b)

Durante el periodo de desagregación se evaluó la viabilidad celular siguiendo el protocolo de tinción de Evans reportado por Giménez et al. (2004). En la Foto 2 se muestran células individuales ligeramente redondeadas, completas, con organelas, lo cual indica el buen estado de la pared celular, característica de células en activo crecimiento.

a – b

c – d

Foto 2 Células típicas de borojó en periodo de desagregación

2.2.1 Cinética de crecimiento celular

Los resultados del crecimiento celular para los cuatro tratamientos se muestran en la Gráfica 1 donde se apreció que la duración de la fase lag es de aproximadamente cuatro días, momento en el cual inicia la fase exponencial con una duración de 5 días la cual finaliza aproximadamente el día 9 del cultivo, al final de la fase exponencial se presenta una caída en el crecimiento celular

Gráfica 1 Cinética de crecimiento celular de B. patinoi para los tratamientos A, B, C y D

Con base en los análisis realizados entre los tratamientos A y C y B y D se determinó que la hormona no tiene ningún efecto diferencial en el crecimiento celular cuando existe la presencia de luz, por el contrario, bajo ausencia de la luz, el 2,4-D produce mayor crecimiento celular, sin embargo, es indiferente cual de los factores se encuentre presente, siempre y cuando haya presencia de al menos uno de ellos se produce crecimiento celular.

2.2.2 Cuantificación de proteína total extracelular

Se cuantificó el contenido de proteína total extracelular en el medio, en el cual se evidencia que el contenido de proteínas aumentó con la edad del cultivo, presentándose mayor producción de proteína en el día nueve, coincidiendo con el tiempo de mayor producción de biomasa.

Gráfica 2. Cuantificación de Proteína total extracelular

La presencia de al menos un factor (hormona 2,4-D o luz) (tratamiento A o B) favorece la producción de proteína extracelular en un 44.91% sobre la presencia de ambos factores (tratamiento C) y de un 58.14% sobre el control (tratamiento D), estos porcentajes corresponden al final de la fase exponencial (día nueve de cultivo). La mayor concentración de proteína obtenida fue de 6.88 g/l en el tratamiento B (2,4-D, no luz); de 6.58 g/l en el tratamiento A (luz, no 2,4-D), 3.79 g/l en el tratamiento C (luz, 2,4-D), en el día nueve de cultivo y de 5.93 g/l en el tratamiento D (control) en el día once de cultivo (Ver Gráfica 2).

La concentración de proteína se incrementó 25 veces con respecto al día cero, misma proporción reportada por Quiroz et al. (2002) para suspensiones celulares de C. arabica, cabe anotar que para B. patinoi el contenido de proteínas estuvo en el orden de g/l mientras que para C. arabica es de µg/l.

2.2.3 Determinación de azúcares no reductores

Las suspensiones celulares de B. patinoi presentaron un aumento en la concentración de azúcares no reductores, por eso no fue posible determinar su consumo neto, es posible que se haya presentado producción de exopolisacáridos, los cuales pueden haberse hidrolizado durante el procedimiento de cuantificación de azúcares no reductores dando unidades de glucosa, fructosa, glucosamina o derivados que pueden reaccionar positivos a DNS y que son comunes en suspensiones celulares.

2.2.4 Determinación de azúcares reductores

Se presentó un aumento en la concentración de estos azúcares a lo largo del cultivo, de acuerdo con lo reportado, el fruto de borojó contiene 6.4 % de azúcares reductores, lo cual indica que no es posible calcular un consumo neto de estos. Es posible que se haya presentado producción de aldehídos reductores en las suspensiones los cuales dan positivos a DNS y hayan alterado los resultados.

2.2.5Análisis químicos

Mediante cromatografía de capa fina se determinó la presencia de sesquiterpenlactonas extracelulares a lo largo de todo el cultivo.

3. Conclusiones

Se establecieron suspensiones celulares de B. patinoi con un activo crecimiento celular cuando se inocularon callos friables en medio líquido MS, suplementado con 30 g/L de sacarosa, 100 mg/L de Ampicilina (grado reactivo), 1 mg/L de 2,4-D, con un inóculo de 20 g BH/L de callo friable con un temperatura promedio de 27 °C, agitación orbital de 160 rpm y régimen total de luz; determinando así que el tiempo necesario para la desagregación celular es de 6 días, momento en el cual se encuentran completamente separados los agregados celulares y la suspensión luce homogénea, siendo este el momento ideal para finalizar la etapa de desagregación e iniciar el cultivo en suspensión de B. patinoi.

De acuerdo con la cinética de crecimiento celular a las condiciones evaluadas, se determinó que el tiempo de la fase lag fue de 4 días, seguida por la fase exponencial la cual tuvo una duración de 5 días (finalizó en el día 9 de cultivo) y finalmente se presentó una etapa de decline hasta el final del cultivo el cual se mantuvo durante 15 días.

Los parámetros estudiados mostraron tener un efecto sobre el crecimiento celular, para obtener un incremento en la biomasa es indiferente cual de los factores se encuentre presente, siempre y cuando haya al menos uno de ellos.

No fue posible relacionar la concentración de los azúcares no reductores con el crecimiento celular, estos en lugar de evidenciar un consumo presentaron una producción neta. De la misma manera se presentó producción de azúcares reductores. Por lo tanto, no se encontró que dichos azúcares estuvieran asociados al crecimiento celular en vista de que éstos tuvieron un comportamiento irregular.

La producción de proteína se encuentra evidentemente asociada al crecimiento celular. El incremento de la proteína aumentó conforme aumentó la edad del cultivo y alcanzó una producción 25 veces más que al inicio del cultivo.

Mediante análisis químicos se encontró de manera cualitativa la presencia de Sesquiterpenlactonas (sesquiterpenos), a las cuales se atribuyen propiedades antitumorales y antimicrobianas.

Bibliografía

Giménez C. y Colmenares M. 2004. Evaluación in Vitro de la resistencia a las toxinas de Mycospharella fijiensis en Musa spp. Departamento de biología, Facultad experimental de ciencias. Universidad del Zulia, Venezuela.

Habeych, David. 2003. Evaluación de Elicitores Químicos sobre la Producción de Indolalcaloides en Células en Suspensión de Catharanthus roseus. Tesis. Universidad Nacional de Colombia. Medellín.

Lowry, O.H. 1951. Protein measurement with the Folin phenol, reagent. J. Biol. Chem. 193,. p. 265-275

Miller, G. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducting sugars. Anal Chem 31 (3): 426-428

Quiroz, F.R.; Rodríguez, S.C. y Loyola V.M. 2002. Patrón proteico extracelular durante la embriogénesis somática en suspensiones celulares de Coffea arabica L. Centro de investigación científica de Yucatán, México.

Roca, W; Mroginski, L. Cultivos de tejidos en la agricultura, fundamentos y aplicaciones. CIAT. 1993.

Carolina Caballero Múnera

Ingeniera de Procesos.

Natalia Cardona Díaz

Ingeniera de Procesos.

Con la colaboración de:

Catalina Giraldo

Ingeniera de procesos

Cesar Hernández

Biólogo MSc Biotecnología.