Efecto de la glucosa sobre la expresión aeróbica de una fusión de operón genómica moa::lac en Escherichia coli K12 (página 2)

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepa bacteriana. Se utilizó un derivado de la CSH41 de E. coli K 12, identificado como OM86: NitGas- Lac+ y contiene la fusión de operón genómica [moa::Mu (lac)) MA25 (Ortega de L. 1982; Ortega de L. 1985). Los genes lac fusionados al promotor pmoa es una estrategia que permite estudiar el control transcripcional del operón moa, cuantificando los niveles de expresión del gen lacZ que codifica para la enzima βgalactosidasa (βGal) (Casadaban y Cohen 1979).

Medios y condiciones de cultivo. La composición del medio mínimo fue descrita por Miller (1972). Las concentraciones de galactosa (Gal), glucosa (Glu) y AMPc (3 '-5' AMP cíclico) (Sigma A-6885) se indicaron en las cinéticas. Las bacterias se incubaron a 300 C. Los cultivos aeróbicos crecieron con agitación fuerte, en fiolas de 250 ml conteniendo 10 ml de medio.

Ensayos enzimáticos. Se utilizaron cultivos aeróbicos, porque muestran los mayores niveles de expresión del gen lacZ fusionado al promotor pmoa (Ortega de L. 1985) y la represión por glucosa es más severa (Dobrogosz 1965, Lee y Dobrogosz 1983, Okinaka y Dobrogosz 1967). La actividad BGal se determinó colorimétricamente siguiendo la hidrólisis del ONPG en células permeabilizadas con tolueno (Miller 1972) que fueron tratadas con cloranfenicol (50 ug/ml) y mantenidas en frío; se utilizó medio mínimo en un lugar del tampón Z y la densidad celular se medió a una absorbancia A550.

Los valores fueron reproducibles en al menos tres experimentos independientes, con un porcentaje de desviación cercano a 10.

RESULTADOS

Cinética de represión transitoria por glucosa en la expresión aeróbica de la fusión moa::lac Previamente se observó que el crecimiento en medio mínimo a expensas de glucosa reduce los niveles de expresión de la fusión de operón genómica moa::lac (Ortega de L. 1985). Por lo tanto, fue de interés estudiar el fenómeno de represión transitoria por glucosa a través de cinéticas aeróbicas e incremento al doble la concentración final de dicho azúcar.

La expresión de la fusión fue estimada considerando la biosíntesis acumulativa de βGal y, a diferencia del cultivo control que se mantuvo creciendo con galactosa, la adición de glucosa disminuyó la expresión durante un tiempo prolongado de la fase exponencial (Fig. 1).

También se ensayaron cuatro concentraciones crecientes de glucosa y las cinéticas se siguieron durante un tiempo más prolongado (Fig. 2A y 2B).

Una curva de crecimiento diáuxico (crecimiento bifásico) fue observada claramente en los cuatro cultivos paralelos y es atribuible al crecimiento en presencia de glucosa y galactosa (Epstein 1966), debido a la exclusión del inductor (la galactosa) más que a la represión catabólica del operón gal (Joseph et al. 1981). El período transitorio de suspensión del incremento en la densidad celular, intermedio entre las dos fases de crecimiento exponencial (período de latencia), es una etapa adaptativa (Epstein 1966) que refleja la síntesis de las enzimas requeridas para utilizar la galactosa, una vez que la concentración de glucosa es limitante (Monod 1949).

En esos cultivos paralelos la expresión de la fusión fue estimada considerando la biosíntesis diferencial de la βGal y la misma se mantuvo en un nivel basal durante el crecimiento exponencial con glucosa, indistintamente de su concentración. Sin embargo, justo al iniciarse el período de latencia, se disparó una etapa de expresión máxima y, de allí en adelante, cuando las células iniciaron su crecimiento exponencial a expensas de galactosa (segunda fase del crecimiento diaúxico), la cinética fue modulada diferencialmente de tal forma que los mayores niveles alcanzados se correspondieron con las menores concentraciones ensayadas de glucosa (Fig. 2A).

Represión permanente y efecto antagónico del AMPc en la expresión aeróbica de la fusión moa::lac.

Una vez demostrada la represión transitoria mediada por glucosa, la etapa subsiguiente fue evaluar la represión permanente. La cinética de expresión aeróbica de la fusión bajo estudio fue estimada considerando los valores relativos de biosíntesis acumulativa de βGal, respecto al control (Fig. 3).

Pudo observarse que, aún en presencia del AMPc exógeno, la glucosa ejerció un efecto negativo y prolongado durante el crecimiento exponencial, ya que los valores relativos fueron inferiores a la unidad. El efecto resultó fuertemente severo durante los primeros 90 minutos, pero a partir de entonces, los niveles comenzaron a incrementar y los valores máximos se alcanzaron cercano a la fase estacionaria (A550 = 0,9).

El AMPc ocasionó una disminución muy ligera en el incremento celular durante el crecimiento exponencial, tal como se ha reportado en otros sistemas (Ralph 1983). El efecto antagónico se manifestó tardíamente después de una noche de incubación aeróbica (fase estacionaria prolongada) (Tabla 1), cuando el cultivo mostró un valor acumulativo cercano a 53% respecto al control, y el mismo correspondió a un 60% (0,28/0,47x 100) de antagonismo frente a la represión mediada por la glucosa.

Las bacterias fueron crecidas a expensas del GLU (2mg/ml), en presencia y ausencia del AMPc (5mM). El cultivo control fue crecido con Gal (2 mg/ml).

Crecimiento celular Nivel acumulado durante una noche de crecimiento aeróbico.

Variación relativa respecto al control, calculada como unidades acumulativas / 500 Porcentaje del efecto respecto al control, calculado como porcentaje de unidades menos 100.

DISCUSIÓN

La sensibilidad a la represión catabólica se ha reportado para diferentes sistemas respiratorios relacionados con la reducción de aceptores finales de electrones como hidrógeno (Jamieson et al. 1986), oxigeno y nitrato (Dobrogosz 1965, Lee y Dobrogosz 1983), asparagina y aspartato (Winkelman y Clark 1986).

Asimismo, la sensibilidad al efecto negativo mediada por glucosa se reportó para el operón moa que participa en la reducción anaeróbica del nitrato y el hidrogeno, a través de la biosíntesis del molibdocofactor, MoCo (Stewart 1988). Este efecto ocurre bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas de crecimiento, según estudios realizados con una fusión transcripcional genómica moa::lac, donde el gen lacZ se expresa bajo el control del promotor pmoa (Ortega deL. 1985).

Con el propósito de caracterizar el efecto glucosa sobre la expresión del operón moa, se realizaron cinéticas aeróbicas estudiando el comportamiento de la referida fusión transcripcional. La expresión aeróbica transcurrió según un proceso bifásico (Ortega de L. 1985), cuyo desarrollo normal estuvo influenciado por el crecimiento a expensas de la glucosa y respondió diferencialmente a los fenómenos de represión transitoria y permanente; también se evidenció un papel medianamente antagonista y tardío por parte del AMPc exógeno.

Cuando se ensayaron concentraciones decrecientes de glucosa, la aparición de los niveles máximos de expresión estuvo asociada con la limitación de glucosa en el medio de cultivo y el tiempo de latencia. Las condiciones fisiológicas que le permitieron a las bacterias recuperarse más rápidamente del efecto glucosa, disminuyeron la eficiencia de la expresión máxima de la fusión bajo estudio.

La represión por glucosa no llegó a bloquear totalmente la expresión, similar a lo reportado para otros genes (de Crombrugghe 1984; Monod 1949), y resultó ligeramente menos severa que cuando las células provenían de un subcultivo crecido aeróbicamente durante una noche (fase estacionaria prolongada) (Ortega de L. 1985). Por lo tanto, el estado fisiológico del cultivo parece desempeñar un papel de control sobre la expresión aeróbica de moa y la capacidad de las células bacterianas para recuperarse eficientemente de la represión mediada por el metabolismo de la glucosa.

No obstante, el efecto represor de la glucosa se manifestó con menor severidad respecto al reportado para el gen lacZ, cuando se expresa a partir de su promotor nativo plac (Monod 1949, Magasanik 1970). También fue diferente al reportado para otros genes procariotas no relacionados funcionalmente con el metabolismo del MoCo y que son sensibles a la represión catabólica; por ejemplo el gen cia que codifica para la colicina Ib, lo cual fue evidenciado estudiando la expresión de la fusión cia::lac (Pugsley 1981).

Las condiciones ensayadas durante la presente investigación permiten inferir que la expresión transcripcional de moa en una cepa silvestre de E.

coli no depende totalmente del control positivo mediado por el complejo AMPc-CAP y posiblemente estaría controlada por más de un proceso distinto. Por ejemplo, podrían participar dos mecanismos de control positivo, autorregulación e inducción por el complejo AMPc-CAP, como fue propuesto para el gen luxR de V. Harveyi (Meighen 1988) y el gen represor cytR de E. coli (Gerlach et al. 1990). Otra alternativa a considerar, es que el complejo AMPc- CAP funcione en forma dual como activador y correpresor, así reportado para el gen tsx de E. coli (Gerlach et al. 1991).

Evidencias acumuladas estudiando diferentes operones parecen indicar que la represión catabólica normalmente puede ser ejercida por controles complejos que implican otros mediadores distintos al AMPc. Así, por ejemplo, cada vez es mayor el número de genes reportados donde el efecto del AMPc es reducido y posiblemente la glucosa actúe indirectamente sobre su expresión transcripcional, como es el caso del fnr y los genes sometidos a su regulación (Spiro y Guest 1990). En la represión por glucosa de genes anaeróbicos pudieran estar participando coefectores nucletídicos potenciales, como el NaDh o la acetil-coenzima A; además fue propuesto un balance comprometedor entre los sistemas metabólicos de oxidorreducción y el flujo reducido de metabolitos (Dobrogosz 1965, Stewart 1988, Spiro y Guest 1990).

AGRADECIMIENTOS

Me complace agradecer al Dr. J. DeMoss (Universidad de Texas, Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular, Houston, USA) sus valorables comentarios sobre esta investigación. Al CDCHTULA (Consejo de Desarrollo Científico, Humanístico y Tecnológico de la Universidad de Los Andes) por el soporte financiero.

REFERENCIAS

Adhya S, Garges S.1982. How cyclic AMP and its receptor protein act in Escherichia coli?. Cell 29: 287-289 Baker K, Boxer D. 1991. Regulation of the chlA locus of Escherichia coli K12: Involvement of the molybdenum cofactor. Mol. Microbiol. 5: 901-907 Brown A, Crothers D. 1989. Modulation of the stability of a gene-regulatory protein dimer by DNA and cAMP. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7387-7391.

Casadaban MJ, Cohen SN. 1979. Lactose genes fused to exogenous promoters in one step using a Mu-Iac bacteriophage: in vitro probe for transcriptional control sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76: 4530-4533.

De Crombrugghe B, Stephen B, Buc H. 1984. Cyclic AMP receptor protein: Role in transcription activation. Science 224: 831-838.

Dobrogosz W. 1965. The influence of nitrate and nitrite reduction on catabolite repression in Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta 100: 553-566.

Epstein W, Naono S, Gros F. 1996. Synthesis of enzymes of the lactose operon during diaux growth of Escherichia coli. Bochem. Biophys. Res. Commun. 24:588-591.

Evans DG. Evans DJ, Karjalainen TK, Lee CH. 1991. Production of colonization factor antigen-Il of enterotoxigenic Eschericia coli is subject to catabolite repression. Current Microbiol. 23: 71-74.

Gerlach P, Sogaardanderesen L, Pedersen H, Martinussen J, Valentinhansen P, Bremer E. 1991. The cyclic-AMP (cAMP) – cAMP receptor protein complex functions both as an activator and as a corepressor at the tsx-P2 promoter of Escherichia coli K l2. J Bacteriol. 173:5419-5430.

Gerlach P, Valentin-Hansen P, Bremer E 1990. Transcriptional regulation of the cytR repressor gene of Escherichia coli: Autorregulation and positive control by the cyclic AMP-CAP complex. Mol. Microbiol. 4: 479-488.

Giordano 6, Boxer D, Pommier J. 1990. Molybdenum cofactor requirement for in vitro activation of apo. molybdoenzymes of Escherichia coli. Mol. Microbiol. 4: 645-650.

Huang L, Tsui P, Freundlich M. 1992. Positive and negative control of ompB Transcription in Escherichia coli by cyclic-AMP and the Cyclic- AMP. J. Bacteriol. 174: 664-670.

Irani M, Adhya S, Musso R. 1989. Cyclic AMP dependent switch in initiation of transcription from the 2 promoters of the Escherichia coli gal operon – Identification and assay of 5’, triphosphate ends of messenger-RNA guanyltransferase. J. Bacteriol. 171: 1623-1630 Jamieson D, Sawers R, Rugman P, Boxer F, Higgins Ch. 1986. Effects of anaerobic regulatory mutations and catabolite repression on regulation of hydrogen metabolism and hidrogenase isoenzime composition in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 168: 405-411.

Johnson J, Wuebbens M, Mandell R, Shih V. 1989. Molybdenum cofactor biosynthesis in humans. Identification of two complementation groups of cofactor-deficient patients and preliminary characterization of a diffusible molybdoperin precursor. J. Clin. Invest. 83: 897-903.

Jhonson M, Rajagopalan K, 1987. Involvement of chlA, E, M and N loci in Escherichia coli molybdopterin biosynthesis. J. Bacteriol. 169:117- 125.

Kalyuzhnaya VM, Korobov VP. 1991. Regulation of betagalactosidase synthesis in Escherichia coli by exogenous cyclic 3’,5'-adenosine monophosphate. Microbiol. 60:47-51.

Lee JH, Dobrogosz W. 1983. Effects of aerobics and anaerobics shock on catabolite repression in cyclic AMP suppressor mutants of Escherichia coli. J. Bacteriol. 154: 992-992 Magasanik B. 1961. Catabolite repression. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 26: 249-256 Meighen E. 1988. Enzymes and genes from the lux operons of bioluminescent bacteria. Ann. Rev.

Microbiol. 42:151-176 Miller JH. 1972. Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory. New York.

Monod J. 1949. The growth of bacterial culturs. Ann. Rev. Microbiol. 3: 371-378.

Moore RC, Boyle SM 1991. Cyclic-AMP inhibits and putrescine repress expression of the spea gene encoding biosynthetic arginine decarboxylase in Escherichia coli. J. Bacteriol. 173: 3615-3621 Okinaka R, Dobrogosz W. 1967. Catabolite repression and pyruvate metabolism in Escherichia coli. J. Bacteriol. 93:1644-1650.

Ortega de L. M. 1982. Molecular: Obtención y caracterización preliminar de clones tansductantes de Escherichia coli K12 llevando fusiones chl::Mudl, seleccionados utilizando tres métodos diferentes. Tesis de maestría en biología. Universidad de Los Andes. Mérida. Venezuela.

Ortega de L.M. 1985. Regulación fisiológica de 105 genes chl de Escherichia coli K12, llevando mutaciones espontáneas y de fusión chl::lac. Trabajo de Ascenso. Universidad de Los Andes. Mérida. Venezuela.

Ortega de L.M. 1994. Control a nivel de transcripción de una fusión de operón moa::lac de Escherichia coli K12: Efectos de diferentes condiciones de cultivo y del operón moa. Suplemento de Acta Científica Venezolana, 45 (1).

Pugsley A. 1981. Transcription regulation of colicin ib synthesis. Mol. Gen. Genet. 183: 522- 527.

Ralph R. 1983. Cyclic AMP, calcium and control of cell growth. FEBS Lett. 161:1-8.

Rivers S, McNairm E, Blasco F; Giordano 6, Boxer D. 1993. Molecular genetics analysis of the moa operon of Escherichia coli K-12 required for molybdenum cofactor biosynthesis. Mole. Microbiol. 8:1071-1081.

Roy A, Haiza C, Danchin A. 1983. Regulation of adeny-late cyclase synthesis in Escherichia coli: nucleotide sequence of the control region. EMBO J.

Schnwtz K, Rak b. 1990. Beta glucoside permease represses the bgl operon of Escherichia coli by phosphorylation of the antiterminatro protein and also interacts with glucose-specific enzyme II, the key element in catabolite control. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5074-5078

Shanmugan K, Boxer D, Cole J. Chippaux M, deMoss J, Giordano 6, Guest J, Gunsalus R, Lin ECC, Rajagoplan K, Stewart V. 1992. Proposed nomenclature for the genes involved in molybdenum metabolism in Escherichia coli and Salmonella typhimurioum. Mol. Microbiol. 6: 3452-3454

Spiro S, Guest J. 1990. FNR and its role in oxygenregulated gene expression in Escherichia coli.FEMS Microbiol. Rev. 75:399-428.

Stewart V. 1988. Nitrate respiration in relation to facultative metabolism in enterobacteria. Microbiol. Rev. 52:190-232.

Ullman A, Monod J. 1968 Cyclic AMP as an antagonist of catabolite repression in Escherichia coli. FEBS Lett. 2: 714-717.

Utsumi R. Noda M, Kawamukai M, Komano, T. 1989. Control mechanism of the Escherichia coli K l2 cell cycle is triggered by the cyclic AMP-cyclic AMP receptor protein complex. J. Bacteriol. 171:2909-2912.

Warnes A, Stephenson Jr, Fooks AR, Melling J, Brown M. 1991. Expression of recombinant protein A from the lac promoter in Escherichia coli-Jm83 is not subject to catabolite repression when grown under specific conditions of continuous culture. Biothechnology and Bioengineering 38:1050-1058.

Winkelman J, Clark D. 1986. Anaerobically induced genes of Escherichia coli. J. Bacteriol. 167: 362-367.

Mariemma Ortega de LópezLaboratorio de Organización y Expresión del Gen (O.E.G.). Departamento de Biología. Facultad de Cencias. Universidad de Los Andes. Mérida, Venezuela.