Efecto de la glucosa sobre la expresión aeróbica de una fusión de operón genómica moa::lac en Escherichia coli K12

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Resumen: Los operones moa y moe de Escherichia coli determinan la biosíntesis de la molibdopterina, en las primeras etapas del metabolismo del molibdocofactor, MoCo. En estudios previos usando una fusión transcripcional, las condiciones de cultivo modularon el nivel de expresión del operón moa y el crecimiento a expensas de glucosa lo redujeron. Este último efecto se investigó en el presente trabajo, realizando cinéticas aeróbicas de crecimiento y actividad enzimática βGal. La glucosa ejerció una represión transitoria que se acentuó con el tiempo de cultivo y retardó el comienzo de la expresión máxima; además el nivel de expresión disminuía al aumentar la concentración de ese azúcar. La represión permanente fue severa durante los primeros 90 minutos, pero disminuyó a lo largo del crecimiento exponencial; en presencia de AMPc exógeno, el nivel de expresión alcanzado incrementó parcial y tardíamente. Los resultados demostraron que la glucosa reprime la expresión transcripcional de a fusión moa::lac. Además, permiten proponer un circuito de control positivo, cuya eficiencia incrementa con el crecimiento del cultivo donde el complejo regulador AMPc-CAP actuaría cuando se alcanza la fase estacionaria.

Palabras clave: Regulación MoCo; expresión moa::lac; represión catabólica moa; glucosa moa.

Abstract: Glucose effect on the aerobic expression of a genomic moa::lac operon fusion in Escherichia coli K12.

In Escherichia coli, the moa and moe operons determine the molybdopterin biosynthesis during the first stages of the molybdocofactor metabolism, MoCo. In previous studies by using a transcriptional fusion, the expression level of the moa operon was modulated by the culture conditions and reduced by growing at the expense of glucose. In the present work, this later effect was researched by monitoring aerobic kinetics of both: growth and enzimatic βGal activity. The glucose carried out a transient repression which was prominent with the culture time and delayed the start of the maximum expression; in addition, by increasing that the sugar concentration the expression level was decreased. During the first 90 minutes, the permanent repression was strong but decreased along the exponential growth; in the presence of cAMP exogenous, the expression level was partial and lately increased. The results demostrated that glucose repress the moa::lac fusion transcriptional expression. In addition, they allow to propose a positive control circuit which efficence is increased with the culture growth, and where the CAP-cAMP regulatory complex could act when the stationary phase is reached.

Key words: MoCo regulation; moa::lac expression; moa catabolic repression; moa glucose.

INTRODUCCIÓN

El efecto represor de la glucosa en Escherichia coli K12 fue reportado originalmente sobre la biosíntesis de la 13galactosidasa ('3Gal.) por Monod (1949). Recibió el nombre de represión catabólica por Magasanik (1961), quien posteriormente lo explicó a través de tres mecanismos distintos: i. Exclusión del inductor desde el interior celular, u. Represión fuerte pero transitoria, cuando la glucosa es añadida a células creciendo con una fuente de carbono diferente (represión transitoria) y iii. Represión débil pero permanente, durante el crecimiento prolongado con glucosa (represión catabólica).

La adición de AMPc (5mM) puede antagonizar en su totalidad los efectos medido por las represiones transitoria y permanente (Kaalyuzhnaya y Koribov 1991, Ullman y Monod 1968). Bajo condiciones fisiológicas, el AMPc es sintetizado por la célula y modula directamente la actividad de la proteína CAP (proteína activadora del catabolito) (Brown y Crothers 1989). El complejo AMPc-CAP generalmente actúa como elemento de control positivo favoreciendo la expresión transcripcional (deCrombrugghe 1984, Utsumi 1989), pero alternativamente puede ejercer un efecto negativo (Adhya y Garges 1982, Moore y Boyle 1991) o ambos (Gerlach et al. 1991, Huang et al. 1992).

En ciertos casos, se ha evidenciado un efecto indirecto ejercido por la glucosa y que puede enmascararse fisiológicamente al cambiar las condiciones específicas de cultivo (Dobrogosz 1965, Lee y Dobrogosz 1983, Okinaka y Dobrogosz 1967, Warnes et al. 1991). Además, el AMPc puede actuar parcialmente (Roy 1983) y no parece ser el único efector que participa en la liberación de la represión catabólica (Lee y Dobrogosz 1983).

La represión por glucosa está asociada con el metabolismo de diferentes azúcares (Irani et al. 1989, Magasanik 1970) y con procesos celulares muy diversos (Dobrogosz 1965, Evasn 1991; Gerlach et al. 1991, Jamieson 1986, Lee y Dobrogosz 1983, Meighen 1988, Moore y Boyle 1991, Okinaka y Dobrogosz 1967, Pugsley 1981, Ralph 1983, Scnetz y Rak 1990, Utsumi 1989, Winkelman y Clark 1986).

Estudios realizados con una fusión transcripcional, evidenciaron que la expresión del operón moa en E. coli es susceptible al efecto negativo de la glucosa (Ortega de L. 1985), sugirieron que el metabolismo del molibdocofactor, MoCo, también podía responder a ese mismo control (Ortega de L. 1985), ya que los operones moa y moe (Rivers et al. 1993, Shanmugan et al. 1992) determinan la síntesis de la pterina, durante las etapas iniciales de su metabolismo (Johnson y Rajagopaln 1987). El MoCo está presente en especies bacterianas (Stewart 1988) y en organismos eucariotas (Johnson 1989); en el primer caso es requerido para la activación de diferentes apomolibdoenzimas de oxidorreducción (Giordano 1990) y una de ellas es la nitrato reductasa A (NRA) que actúa como aceptor final de electrones en la respiración anaeróbica del nitrato (Stewart 1988).

La expresión de la fusión transcripcional antes referida también es susceptible a la concentración incrementada de ciertos efectores que controlan la biosíntesis de la NRA (Ortega de L. y Díaz 1995).

Los niveles de expresión máxima son alcanzados durante el crecimiento aeróbico (Ortega de L. 1985), contrario a lo reportado para una fusión traduccional (Baker y Boxer 1991), y pudiera atribuirse a la participación de controles a nivel transcripcional y traduccional (Ortega de L. 1994).

En el presente trabajo se caracterizó el control negativo mediado por la glucosa sobre la expresión de la fusión moa::lac, realizando cinéticas aeróbicas. La represión transitoria fue evaluada cuantitativamente ensayando además diferentes concentraciones de glucosa y la represión permanente, en presencia y ausencia de AMPc exógeno.