Extracción, aislamiento y caracterización de una sapogenina esteroidal a partir de un extracto hidroalcohólico de Portulaca oleracea.L. (página 2)

MATERIALES Y MÉTODOS

• Recolección: Fue recolectado de un suelo pardo con carbonato en "Las Antillas", UCLV, en período de diciembre a febrero en horas temprana de la mañana.
• Selección: Se realizó eliminando todas las impurezas inorgánicas y toda la materia orgánica extraña.
• Secado:.Se trabajó con la planta completa, fracmentándose en pequeñas porciones y luego se colocó en una estufa (MLW WSU 100, RDA) a una temperatura de 45 ° C durante 9 días.
• Molinado: Posteriormente se molinó el material seco en un molino de cuchillas (Retsch GMBH 5657 tipo SR – 2) y se tamizó utilizando un vibrador de tamices (USS – 50 Tsutsui), para trabajar con un tamaño de partículas homogéneo de 0.3 mm.

Estudio fitoquímico de saponinas.

En la realización del mismo se desarrollaron dos metodologías para la extracción y caracterización de saponinas, teniendo en cuenta los resultados de estudios anteriores, para lo cual se utilizó mayor cantidad de material vegetal.

Además se llevaron a cabo los procedimientos que arrojaron mejores rendimientos

en el estudio anterior.También se tuvo en cuenta la disponibilidad de materiales y reactivos.

Metodología Nro 1

Obtención del crudo de saponinas

Se maceraron 100 gramos de la droga seca y molinada de la planta en 400 ml de etanol al 70 % durante 48 horas, se filtró y se repitió la extracción con la misma cantidad de dicho solvente durante 24 horas. Se reunieron los extractos y se concentraron a sequedad en baño de agua.

El residuo obtenido se disolvió en 10 ml de agua destilada, se colocó en un embudo separador y se extrajo hasta el máximo agotamiento con n – butanol se concentraron los extractos a sequedad en un rotoevaporador (HB4 Basic Kika Lbortechnik) hasta la obtención de un residuo sólido.

Hidrólisis de las saponinas.

Se pesó el residuo del extracto n – butanólico y se disolvió en 20 ml de etanol, se añadió igual volumen de ácido clorhídrico 2 N y se reflujó durante 3 horas; se dejó refrescar para luego evaporar hasta la tercera parte de su volumen inicial y se vertió sobre igual volumen de agua fría. La solución acuosa obtenida se extrajo con acetato de etilo y se concentró a sequedad en un rotoevaporador (HB4 Basic Kika Lbortechnik)

El diagrama de flujo seguido para la obtención de los crudos de saponinas y su posterior hidrólisis se muestran en Anexos (Fig 1).

Metodología Nro 2

Obtención del crudo de saponinas.

Se maceraron 100 g de la droga seca y molida en 300 ml de cloroformo durante 48 horas, se filtró, el extracto clorofórmico se concentró a sequedad en baño de agua. El material vegetal se secó en estufa(MLW WSU 100, RDA) a 35 ° C y se extrajo en Soxhlet con 500 ml de etanol hasta total agotamiento de la droga, se filtró el extracto obtenido y se concentró a sequedad en baño de agua. El residuo obtenido se disolvió en 300 ml de agua saturada con 100ml de n – butanol y se reflujaron con 300 ml de n – butanol durante 2 horas y 30 minutos. La mezcla obtenida se llevó a un embudo separador y se separaron las dos fases, el extracto butanólico se dejó reposar 24 horas para filtrar a vacío sobre sulfato de sodio anhidro (Na2SO4). Posteriormente se concentró a sequedad el extracto butanólico y se pesó. La hidrólisis se realizó exactamente como la metodología anteriormente descrita.

El diagrama de flujo seguido por esta metodología se muestra en Anexos (fig. 2).

Los crudos obtenidos para ambas metodologías se reunieron en una sola fracción para proceder a la separación de los productos de interés.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Estudio fitoquímico de las saponinas

Metodología Nro 1

Obtención del crudo de saponinas.

Después de reunir los extractos hidroalcohólicos obtenidos por maceración y concentrar a sequedad, se obtuvo un residuo de consistencia pastosa y color carmelita – verdoso, para un 15.11 % de extracción.

Prosiguiendo con el proceso de extracción, se obtuvo un residuo n-butanólico de consistencia pastosa y color pardo, con un peso de 9.96 g para un 66 % de extracción del crudo de saponinas.

Hidrólisis de las saponinas.

A partir de los residuos n – butanólicos obtenidos, se obtuvieron las agliconas en la extracción con acetato de etilo teniéndose un residuo de 6.40 g de color verdoso. Esta fracción fue analizada por cromatografía de placa delgada.

Metodología Nro 2

Obtención del crudo de saponinas.

Se obtuvo un residuo de aspecto gomoso, olor a caramelo y coloración verdosa, que pesó 12.35 g, correspondiéndose con el crudo de saponinas.

Una vez hidrolizado el mismo, se obtuvo un residuo de similar aspecto al obtenido por la metodología anterior, con un peso de 5. 83g para un 47.2 % de extracción a partir del crudo.

Identificación de saponinas.

Tamizaje fitoquímico para determinar posibles saponinas.

Con este estudio se analizó la presencia o ausencia de los metabolitos secundarios de interés en el trabajo, las saponinas, así como otras estructuras relacionadas .

Los resultados de este análisis se muestran en la tabla Nro 1

Como se puede apreciar en el caso de los ensayos para triterpenos y esteroides (Liebermann – Burchard, Rosemheim ySalkowsky) los resultados siempre son positivos.

En el caso del ensayo de espuma para saponinas, se puede apreciar que da positivo para el crudo, observándose una espuma abundante y sostenida por más de 5 min, no siendo así para el hidrolizado, lo cual puede explicarse pues en este último caso solo tenemos la parte aglicona de la saponina. Algo similar ocurre con el resultado obtenido para Molish que determina azucares, en el cual se observa un anillo azul – violáceo en la interfase para el crudo de saponinas.

En el caso de las reacciones más específicas para saponinas (antrona) y para sapogeninas (Vainillina), los resultados muestran que luego del hidrolizado puede haber quedado alguna saponina sin hidrolizar. En el primer ensayo hay formación de un anillo azul – verdoso y en el segundo ensayo se detecta la presencia de una coloración azul.

Otro ensayo característico para triterpenos es el de Woller que tambièn da positivo para ambas muestras, aunque el desarrollo de color permanece por más tiempo en la muestra del extracto crudo .

En el ùltimo caso, para determinar la presencia o ausencia de ácidos grasos se utiliza el clásico ensayo de Sudan III, dando positivo en ambos extractos, por la formación de gotículas de grasa apreciables a simple vista

Tabla Nro 1: Resultados de los ensayos realizados para la identificación de saponinas.

+++ Muy positivo o evidente. ++ Positivo.

+ Ligeramente positivo. – Negativo.

Estudios cromatográficos.

Cromatografía en capa delgada.

Se analizaron las diferentes fracciones obtenidas en cada una de las metodologías desarrolladas. Los cromatogramas obtenidos se muestran a continuación (Fig. 4)

A B

A – Metodología Nro 1

B – Metodología Nro 2

m1-Residuo del extracto n-butanólico (crudo de saponinas)

m2-Residuo del extracto hidrolizado(sapogeninas)

Fig. 4-Cromatogramas obtenidos para el crudo de saponinas y el hidrolizado en ambas metodologías.

Como se puede apreciar no hubo una buena separación de los productos obtenidos en el crudo de saponinas, para ambas metodologías.

En el caso de las fracciones post -hidrólisis, podemos apreciar con mayor nitidez la aparición de manchas bastante definidas, de coloración verde.

Cromatografía en Columna.

Mediante esta técnica cromatográfica se reunieron los hidrolizados obtenidos por ambas metodologías con un peso final de 15.79g, para separar adecuadamente los productos. Cada una de las fracciones eluidas se analizaron por cromatografía en capa delgada, especialmente las fracciones de acetato de etilo: n-heptano (1:1) que fueron escogidas para continuar la separación debido a la aparición de los productos de interés.(Fig. 5)

F1– Fracción eluida Nro 1

F2– Fracción eluida Nro 2

F3– Fracción eluida Nro 3

Fig. 5– Cromatogramas obtenidos para las fracciones de interés, eluidas en la Cromatografía en Columna.

Al analizar el recorrido de las manchas se puede apreciar que hubo una buena separación de los productos, obteniéndose tres manchas bien definidas y nítidas en cada caso, de coloración que varía del verde al amarillo verdoso.

Además se compararon de forma preliminar los Rf para cada una de las manchas con un patrón de diosgenina de valor de Rf = 0.51 , observándose similitud entre este y el valor de Rf calculado para la mancha intermedia de las tres fracciones escogidas(Fig. 6). Estas fracciones fueron reunidas en una fracción total de 0.79g con el 5% de la muestra inicial introducida en la columna.

Ft –Fracción total

P –Patrón de diosgenina

Fig. 6 –Cromatogramas del patrón de diosgenina comparado con el de una fracción total eluída en la mezcla acetato de etilo: n –heptano (1: 1)

Las restantes manchas no pudieron ser analizadas por no contar con disponibilidad de otros patrones

Cromatografía de placa preparativa

Con el objetivo de arrastrar la mancha de interés eluida por la columna, para su posterior análisis espectroscópico, desarrollamos la técnica de cromatografía preparativa.

Los resultados de la misma se muestran en la Fig. 7. Como se puede apreciar obtuvimos tres franjas de colores: verde oscuro, amarillo – verdoso y verde claro respectivamente. La franja de color amarillo -verdoso luego de ser adecuadamente marcada, se arrastró y disolvió en la mezcla de acetato de etilo: n-heptano (1:1).

Fig. 7 –Cromatograma de la fracción de interés eluida por la columna obtenida mediante una técnica preparativa

Luego de ser decantado y filtrado con papel de filtro, para eliminar los restos de silica, se dejó reposar durante tres días, al cabo de los cuales observamos la aparición de un precipitado blanco amarillento, con un peso de 0.21g.Esto se corresponde con el 1.33% del hidrolizado total introducido en la columna.

Este producto se comparó con el patrón de diosgenina mediante cromatografía de placa delgada, bajo las mismas condiciones cromatográficas empleadas anteriormente. Como muestra la Fig. 8, el producto aislado presenta un Rf muy similar al patrón.

Este producto aislado de la fracción post- hidrólisis en acetato de etilo: n– heptano (1:1) se corresponde con el 0.1% de la muestra inicial de 200g de planta seca y molinada que se empleó en el estudio.

m– Producto aislado p– Patrón de diosgenina

Fig. 8 – Cromatogramas del producto aislado y el patrón de diosgenina.

Se realizó la detección del punto de fusión a la muestra en una microplatina digital (elctrothermal 9200) y el rango de valor detectado fue entre 206 y 209ºC.

Estudios espectrocópicos

Espectroscopia UV

El espectro obtenido se muestra en Anexos (Fig. 9)

Atendiendo al espectro UV se puede sugerir la presencia de transiciones ns * que corresponde con los grupos hidroxilos alcohólicos, lo cual se puede corroborar con los resultados del espectro IR.Adicionalmente se realizó el ensayo de identificación con sodio , este resultó positivo, indicando la posible existencia en el compuesto de los grupos mencionados.

Espectroscopia IR

El espectro obtenido se muestra en Anexos (Fig. 10)

Al realizar el análisis del mismo pudimos observar lo siguiente:

• 3449.82 cm-1, banda puntiaguda y ancha indicativa de OH asociado y de una posible superposición, lo que sugiere que el OH pueda ser primario, secundario o terciario presentes en flavonoides, alcaloides y triterpenos. Estas bandas aparecen entre 3800cm-1 y 3500cm-1, según la literatura.
• 2951.09 cm-1, banda alargada y estrecha indicativa de la presencia de enlaces C SP3 –H. Estas bandas aparecen entre 3000cm-1 y 2800cm-1, según la literatura.
• 1637.35 cm-1 , banda pequeña de hombro ancho indicativa de la presencia de enlaces C- N. Lo cual sugiere que el compuesto se encuentra en forma de sal . Estas bandas aparecen en 1640cm-1, según la literatura.
• 1456.69cm-1, banda pequeña y estrecha indicativa de la presencia de enlaces C=C. Estas bandas aparecen en 1460cm-1, según la literatura.
• 1376.67 cm-1 , banda estrecha y puntiaguda indicativa de la presencia de enlaces C sp2 – H. Estas bandas aparecen en 1380cm-1, según la literatura.
• 1052.51 cm-1 , banda alargada y estrecha indicativa de la presencia de enlaces C – O simple . Estas bandas aparecen en 1050cm-1, según la literatura.
• 1241.52 cm-1 – 642.29 cm-1, bandas características de la presencia del anillo bencénico. Estas bandas aparecen entre 1000 cm-1 y 600 cm-1, según la literatura.
• 981.78cm-1, 920.14cm-1, 899.43cm-1, 865.17cm-1, cuatro bandas características de sapogeninas esteroidales debido a la presencia del anillo F. Estas bandas aparecen a 985cm-1,920cm-1, 900cm-1 y 860cm-1 respectivamente, según la literatura. Además como la banda de 900cm-1 es más intensa que la de 920cm-1 estamos en presencia de una isosapogenina .

Luego de analizar nuestro producto aislado tanto por métodos cromatográficos como espectroscópicos , le asignamos la estructura química de la diosgenina (

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

CONCLUSIONES

1. Se desarrollaron las metodologías óptimas, teniendo en cuenta los estudios anteriores, para la extracción del crudo de saponinas y su posterior hidrólisis.
2. Se aisló la sapogenina de interés mediante cromatografía de placa preparativa, comparándose con un patrón de diosgenina mediante cromatografía de placa delgada .
3. Se caracterizò por UV, IR y punto de fusión el producto aislado, asignándole la estructura de la diosgenina .

RECOMENDACIONES

• Profundizar en la identificación y caracterización estructural de las fracciones obtenidas.
• Realizar la purificación de la muestra en varias placas preparativas para obtener un mayor número de cristales que faciliten la mejor caracterización del producto.

Autor:

Lic Tania L. Santos Morell

Lic. Ivonne Torres Chaviano

Lic. Laritza Rodríguez Odales.

Año 2005