ELISA de avidez (página 2)

Métodos indirectos

Se basan en la aplicación de un anticuerpo primario sobre el tejido que es reconocido por un segundo anticuerpo, secundario, contra la región Fc del primario, unido a un marcador. El anticuerpo secundario se aplica a una concentración en exceso. Estos métodos son mucho más sensibles que los directos pues al anticuerpo primario se pueden unir más de un anticuerpo secundario, incrementando la señal. Otra ventaja de estos métodos es que basta con disponer de unos pocos secundarios marcados para poder reconocer un gran número de anticuerpos primarios diferentes.

El marcaje del anticuerpo secundario es más fácil pues al obtenerse contra las inmunoglobulinas de una especie se dispone de gran cantidad de antígeno puro y se suelen inmunizar animales grandes (cabra, oveja, caballo, etcétera) con lo que se dispone de gran cantidad de anticuerpo para la reacción. El límite en el número de antígenos que es posible detectar se encuentra en el número de anticuerpo secundarios distintos de que se dispone acomplejados con marcadores diferentes.

Objetivos

Determinar la avidez de anticuerpos provenientes de suero de ratón infectado con T. cruzi, obtenidos a distintos tiempos post-infección (evaluando la evolución de su avidez), mediante un ELISA de avidez. En esta se desafiará la unión antígeno-anticuerpo con urea 6M, por el principio de elución.

Procedimientos

Los sueros diluidos 1/50 se incubaron por sextuplicado, realizando el tratamiento con urea 6M en 3 de los pocillos (como se indica en la figura 1). Se utilizaron 1 suero correspondiente a un ratón sin infectar (fila A de la placa en la figura 1) y 6 sueros de ratones infectados (filas B, C, D, E, F Y G). En la fila H se incluyen los controles sin suero (solo diluyente), en las columnas 1, 2 y 3 sin anticuerpo anti-IgG ratón infectado y en las columnas 4, 5 y 6 con anticuerpo anti-IgG ratón infectado.

Se sensibilizaron las placas a 4ºC "overnight", y se realizó un primer tratamiento caotrópico con urea 6M (en todos los pocillos) 30 minutos a 37ºC. Este tratamiento es necesario para eliminar aquellos antígenos que pudieren pegarse a la placa con baja avidez. Después se bloqueó con PBS-leche descremada al 5% 1 hora a 37ºC, y se incubó con los sueros diluidos 1/50 en PBS-leche descremada al 1% 1 hora a 37ºC. Se lavó la placa 5 veces con buffer de lavado (PBS-Tween 20 al 5%). A partir de aquí se siguieron 2 tratamientos: en los pocillos 4, 5 y 6 se incubó con PBS-urea 6M 30 minutos a 37ºC, y en los pocillos 1, 2 y 3 se incubó con PBS 30 minutos a 37 ºC. Volvieron a lavarse las placas 5 veces en buffer de lavado, y luego se incubó 1 hora a 37ºC con el anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa y diluido en PBS-leche descremada al 1%. Se lavaron los pocillos 5 veces más con buffer de lavado y se reveló la placa con H2O2 y TMB (tetrametilbencidina), dejando incubar por 15 minutos. Se cortó la reacción con H2SO4 2N y se lee a 450 nm en el espectrofotómetro.

Figura 1: Esquema de la placa del ELISA de avidez

Por último, se calcularon los índices de avidez dividiendo el valor medio de la densidad óptica obtenido en los pocillos tratados con urea 6M (4, 5 y 6, filas Bà G) por el valor medio de la densidad óptica de los pocillos no tratados (1, 2 y 3, filas Bà G), y multiplicando este valor por 100.

Resultados

En la Figura 2 se puede observar la placa del ELISA de avidez. En los pocillos 1 a 3 se realizó el tratamiento con PBS y en los pocillos 4 a 6 se realizó el tratamiento con PBS y Urea 6M. Las distintas filas corresponden a los sueros de ratón obtenidos a distintos tiempos post infección. En la última fila se realizó el control sin suero.

Figura 2: Placa del ELISA de avidez.

La reacción de la peroxidasa fue interrumpida con H2SO4 y se midió la absorbancia a 450 nm en un espectrofotómetro de ELISA (Figura 3).

Figura 3: Placa de ELISA de avidez con H2SO4.

Con los datos obtenidos del espectrofotómetro de ELISA se realizó una tabla (Tabla 1) y se procedió a calcular los índices de avidez (Av).

Tabla 1: Tabla correspondiente a los valores obtenidos del espectrofotómetro del ELISA.

El Ratón 1 es un ratón control no infectado, por lo cuál el índice de avidez da alto (debería dar 100%, ya que no deberían pegarse anticuerpos tanto en el tratamiento con PBS como con el tratamiento con Urea 6M), y se utilizó como blanco del resto de los sueros. El control sin suero da 100%, lo cuál es esperable ya que no hay anticuerpos.

Con estos datos se procedió a graficar como varía la respuesta inmune (aumento de la avidez) en función al tiempo post infección (Figura 4).

Figura 4: Evolución de la respuesta inmune en el tiempo.

Conclusiones

Podemos concluir que a medida que madura la respuesta inmune los anticuerpos generados son más ávidos (con mayor afinidad), y que el ensayo de ELISA de avidez nos permite comparar distintos sueros contra un antígeno específico y determinar cual de ellos tiene mayor avidez por el mismo.

Autor:

Sebastián Ferraro

Guz Lucas

Melli Luciano

Rapoport Ayelén

Shalóm Fabián

Universidad Nacional de General San Martín

Inmunología Molecular