Especificidad de la técnica HPLC para la evaluación de la estabilidad química del sólido pulverulento de Parthenium hysterophorus, Linn, en base a partenina (página 2)

Estudio de estabilidad. Condiciones de estrés

Procedimiento experimental. Se pesó tres réplicas correspondientes a 0,1 g del sólido pulverulento se colocaron en frascos ámbar y protegidos de la luz, y se mantuvieron durante tres meses en las siguientes condiciones:

Estudio de estabilidad acelerada: 40°C ± 2°C/75% ± 5% HR. Condición del envase: frasco ámbar con tapón de goma protegido de la luz. (ICH, 2003)

Ensayo de estrés de humedad: 25°C ± 2°C/80% ± 5% HR (ICH, 2003). Condición del envase: frasco destapado protegido de la luz.

Estabilidad a largo plazo: 30°C ± 2°C/65% ± 5% HR (ICH, 2003). Condición del envase: frasco ámbar con tapón de goma protegido de la luz.

Preparación de las muestras de ensayo: Coincide con lo reportado anteriormente.

Análisis de las características organolépticas: Se observó el comportamiento organoléptico, teniendo en cuenta el olor, color y aspecto de los sólidos pulverulentos a tiempo inicial y a los tres meses.

Análisis Químico: Se aplicó la técnica de determinación cuantitativa de partenina en los sólidos pulverulentos de Parthenium hysterophorus, Linn., mediante HPLC desarrollada para determinar el contenido de su principal ingrediente activo, la partenina, a tiempo inicial y a los tres meses. Se realizó el cálculo del por ciento sin degradar de partenina con relación a su concentración en la muestra inicial a tiempo cero.

Estabilidad acelerada y de vida estante

Procedimiento experimental. Se pesó tres réplicas correspondientes a 0,1 g del sólido pulverulento se colocaron en frascos ámbar y protegidos de la luz, y se mantuvieron durante tres meses en las siguientes condiciones:

Estudio de estabilidad acelerada: 40°C ± 2°C/75% ± 5% HR. Condición del envase: frasco ámbar con tapón de goma protegido de la luz. (ICH, 2003)

Estabilidad a largo plazo: 30°C ± 2°C/65% ± 5% HR (ICH, 2003). Condición del envase: frasco ámbar con tapón de goma protegido de la luz.

Análisis de las características organolépticas: Se observó el comportamiento organoléptico, teniendo en cuenta el olor, color, sabor y aspecto de los sólidos pulverulentos a tiempo inicial y a los tres meses.

▲ Análisis Químico: Se aplicó la técnica de determinación cuantitativa de partenina en los sólidos pulverulentos de Parthenium hysterophorus, Linn., mediante HPLC para determinar el contenido de su principal ingrediente activo, la partenina, a tiempo inicial y a los tres meses. (Polin L., 2006). Se realizó el cálculo del por ciento sin degradar de partenina con relación a su concentración en la muestra inicial a tiempo cero.

Especificidad de la técnica analítica HPLC para estabilidad

Se evalúo la especificidad de la técnica analítica HPLC con vistas a su aplicación en estudios de estabilidad del sólido pulverulento y se valoró la posible interferencia de productos de degradación con relación a la respuesta cromatográfica del ingrediente activo principal. Se valoró el perfil cromatográfico de cada condición analizada, al ser sometidas las muestras de ensayo a degradaciones en diferentes condiciones extremas que propicien la degradación del ingrediente activo. Para ello se evaluaron las respuestas cromatográficas a cada condición analizada, al ser sometidas las muestras de ensayo a degradaciones en diferentes condiciones de estrés como: medio ácido (HCl 1mol/L), medio básico (NaOH 1 mol/L), oxidación (H2O2 al 3 %), la luz solar y ultravioleta, teniendo en cuenta lo referido en las normas de la conferencia internacional de armonización (ICH, 1996) al evaluar la especificidad de técnicas de análisis frente a posibles productos de degradación.

El cromatograma obtenido mediante HPLC de la sustancia de referencia y de la muestra inicial a tiempo cero, evidencian un pico cromatográfico bien definido y resuelto a un tiempo de retención de 5,2 correspondiente al ingrediente activo de interés. (Fig. 2 y 3).

• Medio básico: Se obtiene un pico en el cromatograma obtenido mediante HPLC a un tiempo de retención (tr) de 7,2 min, lo cual podría darnos un criterio de la presencia de un producto de degradación de menor polaridad con relación al ingrediente principal, la partenina. Los resultados de la concentración de ingrediente activo (%) muestra una reducción significativa con relación al contenido de partenina en la muestra sin degradar. (Tabla 2) (Tabla 3) (Fig. 2)

Tabla 2. Valores de concentración (%) para la muestra de análisis a tiempo cero.

Tabla 3. Concentración de partenina (%) en el sólido pulverulento y % de partenina sin degradar en relación a su concentración inicial.

• Medio ácido: Se obtiene un pico en el cromatograma obtenido mediante HPLC a un tiempo de retención (tr) de 6,3 min, bien definido, sin colas, ni solapamientos. Los resultados de la concentración de ingrediente activo (%) muestran una reducción significativa con relación al contenido de partenina en la muestra inicial a tiempo cero. (Tabla 2) (Tabla 3) (Fig. 3)

Medio oxidante: Se obtiene un pico en el cromatograma HPLC a un tiempo de retención (tr) de 7,3 min., con ausencia de picos solapados. Los resultados de la concentración de ingrediente activo (%) muestran una reducción significativa con relación al contenido de partenina en la muestra sin degradar. (Tabla 2) (Tabla 3) (Fig. 4)

Luz solar: Se obtiene un pico en el cromatograma HPLC a un tiempo de retención (tr) de 7,05 min., con ausencia de picos solapados. Los resultados de la concentración de ingrediente activo (%) muestran la no existencia de diferencias significativas con relación al contenido de partenina en la muestra sin degradar. (Tabla 2) (Tabla 3) (Fig. 5)

Luz UV: Se obtiene un pico en el cromatograma HPLC a un tiempo de retención (tr) de 7,71 min, con ausencia de picos solapados, lo cual evidencia la formación de un posible producto de degradación de estructura química similar y de una menor polaridad, teniendo en cuenta las condiciones cromatográficas establecidas. Los resultados de la concentración de ingrediente activo (%) muestran una reducción significativa con relación al contenido de partenina en la muestra sin degradar. (Tabla 2) (Tabla 3) (Fig.6)

Fig. 6. Cromatograma HPLC obtenido para la muestra de análisis bajo el efecto de la luz artificial (UV).

El análisis comparativo de los cromatogramas obtenidos para la sustancia de referencia, muestra inicial a tiempo cero y las muestras sometidas a las condiciones de degradación drásticas, demuestra la especificidad del método analítico HPLC, al no evidenciarse interferencias, ni solapamientos con relación al pico que eluyó a un tiempo de retención de 5,2 min correspondiente al ingrediente activo principal.

Atendiendo a los resultados obtenidos, se evidencia la mayor incidencia en la concentración de la partenina de la condición degradativa en medio básico, que alcanza prácticamente el 80 % de degradación, seguida de la degradación oxidativa, posteriormente del medio ácido y finalmente se muestra que la menor afectación de la concentración del ingrediente activo principal se obtiene bajo el efecto de la luz artificial y luz solar.

Cromatografía en capa delgada cualitativa (CCD)

La determinación de las razones de flujo (Rf) de cada una de las muestras analizadas, sometidas a las diferentes condiciones degradativas en comparación con la solución de referencia evidenció los siguientes resultados:

• Medio básico: Aparición de una mancha fluorescente a la luz ultravioleta a un valor de Rf de 0,67. Se evidenció la presencia a la luz ultravioleta de una segunda mancha fluorescente a un valor de Rf de 0,98, no siendo detectada al revelado con vainillina.

• Medio ácido: Aparición de una mancha fluorescente a la luz ultravioleta y de color carmelita al revelado con vainillina a un valor de Rf de 0,125. Se evidenció la presencia de una segunda mancha fluorescente a la luz ultravioleta y de color verde al revelado con vainillina a un valor de Rf de 0,93.
• Medio oxidante: Aparición de una mancha fluorescente a la luz ultravioleta y de color carmelita al revelado con vainillina a un valor de Rf de 0,26. Se evidenció la presencia de una segunda mancha fluorescente a la luz ultravioleta, no siendo detectada al revelado con vainillina a un valor de Rf de 0,98.

Se evidencia atendiendo a los resultados anteriores, la presencia de posibles productos de degradación en cada medio analizado, detectándose dos nuevas sustancias en cada condición, en comparación con la sustancia de referencia fluorescente a la luz ultravioleta y de coloración azul violácea al asperjado con vainillina, presentando un valor de Rf de 0,5.

Espectrofotometría ultravioleta directa

• Muestra inicial a tiempo cero.

El espectro UV del sólido pulverulento en metanol en el intervalo de 200 a 300 nm evidenció la presencia de un máximo de absorción a una longitud de onda de 215 nm, correspondiente a una transición (π-π*) característico de las enonas. (Fig.7)

Fig. 7. Espectro UV del sólido pulverulento del Parthenium hysterophorus, Linn en metanol.

• Medio ácido y básico. Caracterización espectrofotométrica cualitativa.

El espectro UV de la muestra objeto de análisis sometida a la degradación en medio ácido mostró la presencia un máximo de absorción a una longitud de onda de 206 nm. (Fig.8)

El espectro UV de la muestra sometida a la degradación en medio alcalino evidenció la presencia un máximo

▲ Solubilidad del producto cristalizado.

El producto cristalizado en forma de finas agujas blanquecinas, es soluble en ácido clorhídrico 1 % y en agua, lo cual pudiera inducirnos a concluir que se obtuvo bajo esta condición una sal, teniendo en cuenta las consideraciones teóricas sobre un posible mecanismo de degradación en medio básico.

• Medio oxidante. Caracterización espectrofotométrica cualitativa.

El espectro UV de la muestra sometida a la degradación oxidativa con peróxido de hidrógeno al 3 %, evidenció la presencia de un máximo de absorción a una longitud de onda de 221 nm, correspondiente a una transición (π-π*), lo cual corroboró el pico característico de las enonas entre 215- 250 nm. (Fig.10)

Fig. 10. Espectro UV de la muestra de análisis sometida a degradación en medio oxidativo.

Los espectros UV obtenidos como resultados de la evaluación de las muestras sometidas en cada medio de degradación (ácido, básico, oxidativo) mostraron máximos de absorción, característicos de la banda de transición (π-π*) de las enonas, lo cual infiere la presencia de posibles productos de degradación de estructura química similar a la partenina y confirma, además, que éste método analítico no es recomendable en la realización de estudios de estabilidad del sólido pulverulento.

Autor:

Msc. Yanelis Saucedo Hdez

Lic. Bassam Mohamad Safa

Dra. Mirtha Mayra González Bedia

Dr. Dr. Luis Ramón Bravo Sánchez

Dra. Elisa Jorge Rodríguez

Téc. Adalberto Quintana

Téc. Ana Hernández Monzón

Universidad Central de las Villas. Departamento Farmacia. Facultad de Química Farmacia. Cuba.