Electroporación para células pegadas
Biobalística
Microinyección
Métodos de transfección
Vectores de expresión eucariontes Elementos para clonado en bacterias ori de replicación Marcador de selección bacteriano Sitios múltiples de clonado
Elementos específicos de vectores eucariontes _ Promotor eucarionte Señal de poliadenilación Secuencias Kozak y codón ATG Intrón Tags-proteínas de fusión ori de replicación eucarionte como el de SV40 (opcional) Marcador de selección para células eucariontes (para transfecciones estables) Segmentos de DNA para recombinación homóloga
Vector de expresión eucarionte
Promotores eucariontes Constitutivos: SV40 RSV CMV hEF-1a Ubc Inducibles: Tet o T-Rex inducilbe por tetraciclina Olac inducible por IPTG Metalotioneína inducible por metales pesados GAL4-E1b inducible por mifepristona
Tags Glutation-S-transferasa His V5 Hemoaglutinina (HA) Myc Flag EGFP
Elementos de control de la traducción 5’ leader 3’ trailer 1 2 3 5 gen de interés 4 Región transcribible del gen 1 AUG (secuencia Kozak = CCRCCAUGG) 2 Secuencia señal de secreción 3 Tag para su purificación Sitio de clivaje proteolítico Señal de poliadenilación
Transfección transiente (48-72 horas) Análisis rápido Múltiples propósitos Análisis de secuencias regulatorias
Vector de expresión
Vector de expresión
Proteínas producidas en cultivos de células eucariontes Proteína Condición Factor IX & VIIIc hemophiliacs CD4 receptor AIDS erythropoetin cancer b & g interferons cancer Interleukin-2 cancer growth hormone dwarfism tissue plasminogen activator heart attack/stroke Hepatitis B surface antigen vaccine monoclonal antibodies various
Vector de fusión a EGFP
Vector de fusión a ZsYellow
(Gp:)
Expresión de proteínas fluorescentes Proteína fluorescente verde
Vector de anclaje a membrana de la proteína
Vector de secreción de la proteína
Dos vectores de expresión diferentes El número de copias de cada plásmido puede ser diferente La expresión de cada proteína puede ser diferente
Vectores que expresan dos genes Cada gen es una unidad transcripcional y tiene su promotor y secuencia de poliadenilación Pueden no expresar la misma cantidad de protína
Vectores dicistrónicos Posee un solo promotor 2 genes a partir de la misma unidad transcripcional Se sintetiza un solo mRNA Necesita un sitio interno de unión al ribosoma IRES proviene del genoma de virus de mamíferos
Vectores dicistrónicos
(Gp:) Gen reportero para análisis de promotores
ANALISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA (Gp:) PROMOTOR (Gp:) exón 1 (Gp:) exón 2 (Gp:) intrón (Gp:) 5’ (Gp:) 3’
(Gp:) transcripción (Gp:) La mayoría de los cambios en los niveles de mRNA ocurren por variaciones en la transcripción. (Gp:) m7GpppN (Gp:) AAAAAA (Gp:) 5’ (Gp:) 3’ (Gp:) mRNA
Los genes reporteros son secuencias que codifican para proteínas de simple detección. Se usan para reemplazar productos génicos difíciles de medir y determinar actividad promotora. (Gp:) PROMOTOR (Gp:) exón 1 (Gp:) exón 2 (Gp:) intrón (Gp:) 5’ (Gp:) 3’
(Gp:) PROMOTOR (Gp:) GEN REPORTEROe.g. luciferasa
Estrategia de genes reporteros
CAT (cloramfenicol acetiltransferasa)Transfiere grupos acetilos marcados 14C o 3H al cloramfenicol.La detección se da por cromatografía en capa delgada o extracción orgánica GAL (?-galactosidasa)Hidroliza sustrato incoloro (ONPG) para dar producto amarillo que se cuantifica SEAP (secreted human placental alkaline phosphatase)Ensayo de fosfatasa alcalina bioluminiscente. Muy sensible LUC (luciferasa)Oxida a la luciferina emitiendo fotones. Los fotones se cuentan en un luminómetro o una cámara de recuento de fotones (ensayo in vivo). Hay diferentes luciferasas dispoinibles GFP (green fluorescent protein)Fluoresce por irradiación con UV – se observa con microscopio de fluorescencia. Genes reporteros
Vector para analizar secuencias promotoras.
Vector para analizar secuencias promotoras.
Vector control-secuencias regulatorias
Vector control-secuencias regulatorias
Diseño y construcción del vector Ensayo de genes reporteros Introducción en células por transfección transiente o estable (Gp:) Gen reportero (ej luciferasa)
Ensayo de actividad Gen control (ej b-galactosidasa) Cálculo de actividad promotora
Vector control de eficiencia de transformación
Vector control de eficiencia de transformación
Co-transfección de genes reporterosDual Luciferase Assay system – Promega Se clona el promotor de interés delante del gen de luciferasa (firefly) y se usa la luciferasa de Renilla como control interno La luciferasa de Renilla se expresa de un promotor constitutivoe.g. SV40 I/E HSV TK
Ejemplo de resultado
Analisis de una región promotora Qué secuencias están involucradas en la regulación?Análisis de genes reporteros y análisis por deleción CIS -acting elementsElementos de respuesta
Qué proteínas se unen a estos elementos?Análisis de DNase I footprinting Ensayo de retardo en gel CHIP TRANS -acting factors e.g. factores de transcripción específicos
Interacción de proteínas:Doble híbrido en células de mamífero
pBIND
pACT
pG5/luc
Ejemplo de resultados
Transfección estable Por integración Por recombinación homóloga Como episoma
Requiere de un marcador de selección en el vector Util para estudios que impliquen inducción de la expresión
Marcadores de selección eucariontes Agent Action Marker Gene
Blasticidin S Inhiben síntesis BlasticidinS deaminase Hygromycin B proteica Gen hyg o hph Puromycin G-418 Neomycin phosphotransferase Zeocina Intercalante del DNA gen Sh ble, se une MTX Inhibits DNA syn. Dihydrofolate reductase
Marcadores de selección Metotrexate (MTX) Mata a las células que carecen de dihidrofolato reductasa La línea celular huesped debe ser DHFR- El vector contiene el gen DHFR Incrementos en [MTX] aumenta el número de copias génicas G418 (Geneticina) Bloquea la traducción La resistencia es la neomicina fosfotransferasa ( Neor ) Para células de mamífero, plantas y levaduras Zeocina – Antibiótico de la familia bleomicina – Cliva el DNA – El producto del gen ble se une e impide el pegado al DNA. -de amplio espectro (mamíferos, levaduras y bacterias)
Vector episomal
Sistema de recombinación homóloga Flp-in Invitrogen: Recombinación sitio específica de Saccharomyces cerevisiae Sitio FRT (Flp recombination target) Recombinasa Flp
Vector que contiene el sitio FRT
Pasos de recombinación homóloga 1- Generar línea que posea el sitio FRT
Vector de clonado del gen de interés
Vector de clonado del gen de interés
Vector de expresión de la recombinasa
2- Cotransfectar con vector con gen de interés y vector de expresión para recombinasa
Resultado
Sistema siRNA
Estrategias siRNA
Vector siRNA
Sistema reprimible por tetraciclina
Sistema inducible por tetraciclina
Vector de expresión del regulador
Vector de expresión del regulador
Vector de clonado del gen de interés
Vector de expresión para dos genes regulados por tet
Vector de expresión de proteínas en leche
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