La introducción de DNA en las células procariontes y levaduras se llama Transformación La transformación de células eucariontes superiores se refiere a cambios en las características del cultivo celular Por ello se utiliza el término transfección para denominar la entrada de DNA foráneo a la célula
Fibroblastos humanos COS
Cultivos primarios
Lineas celulares establecidas
Por transformación con oncogenes Provenientes de tumores Cultivos celulares
Curva de cultivos celulares TRF Divisiones celulares Somáticas (telómeros se acortan telomerasa inactiva) Germinales (telomerasa activa) senecencia crisis Extensión de la vida celular Células inmortales (tel.activa)
TRANSFECCIONES OBJETIVOS Expresión de proteínas para su purificacón Expresión de proteínas para estudiar su efecto sobre el fenotipo celular Estudio de promotores y elementos regulatorios Estudio de mecanismos involucrados en el procesamiento del RNA, postraduccionales, etc. Interacción de proteínas Clonado Terapia génica
Problemas que pueden surgir de expresar proteínas en sistemas procariontes
Inestabilidad Sin actividad biológica Contaminantes procariontes Características bioquímicas diferentes
Modificaciones postraduccionales imcompletas o ausentes
Clivaje proteolítico Glicosilación Alteraciones de los aminoácidos fosforilación acetilación Sulfatación Adición de ácidos grasos
Depende del tipo celularHeLa, HEK 293T, COS7, Liposomas alta eficiencia, no-tóxicoe.g. Lipofectamine Plus (Invitrogen), Tfx20 (Promega) Fosfato de calcio simple, baja eficiencia DEAE-dextrano simple, alta efficiency, no para estable Electroporación alta eficiencia, altos niveles de muerte Microinyección laborioso, alta eficiencia Biobalística para células vegetales Retrovirus muy eficiente, trabajoso
Métodos de Transfección
Liposomas: mezcla Moléculas lipídica catiónicas (N,N,N´,N´-tetramethyl-N,N´-bis(2-hydoxyethyl)-2,3-di(oleoyloxy)-1,4-butane-diammonium iodide) Y de un lípido neutro L-dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE).
Electroporación
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