Análisis estadístico
Para estos experimentos se aplicó un diseño totalmente aleatorizado. Para los análisis estadísticos se empleó el programa Statgraphics Versión 5.1 (2000). Para cada población de datos se analizaron que éstos cumplían la distribución normal (Kolmogorov –Smirnov) y que cumplían con la prueba de homogeneidad de la varianza (Bartlett).
Los resultados se procesaron estadísticamente a través de un análisis de varianza de clasificación simple, con un diseño completamente aleatorizado. Los datos en porcentajes se transformaron según X = 2arcsin (X/100) 0.5. Para detectar la diferencia entre las medias se realizó un ANOVA y la Prueba de Rangos Múltiples de Duncan para el 5% de significación.
Resultados y discusión
Evaluación de la respuesta morfogénica de explantes de henequén sembrados en altas concentraciones de auxinas
En la Tabla 1 se puede observar que la interacción entre los factores en estudio (tipo de auxina-concentraciones) fue significativa. El mayor porcentaje en la formación de callo primario se indujo cuando el explante se cultivó sobre medio suplementado con 2,5 mg/L y 5,0 mg/L de 2,4-D, tratamientos que se diferenciaron significativamente del resto de los ensayados.
a, b, c, Letras distintas difieren estadísticamente para p<0.05
Tabla 1 Efecto del tipo de auxina y concentración de esta sobre el porcentaje de la formación de callo primario en explantes de henequén.
En general, el porcentaje de explantes cultivados que no formaron callos (explantes ennegrecidos, sin respuestas o contaminados con bacterias y hongos) no superó el 40% para la auxina 2,4-D por lo que se puede decir que el establecimiento in vitro fue exitoso, sin embargo para el Picloram el porcentaje de explantes cultivados que no formaron callos (explantes ennegrecidos, sin respuestas o contaminados con bacterias y hongos) superó el 60% lo que indica que esta auxina a las concentraciones empleadas no ejerció una respuesta comparable con el 2,4-D. Analizando el control el porcentaje de cultivos sin respuestas alcanzó el 100%, aspecto este que demuestra la necesidad de emplear reguladores del crecimiento del tipo auxina combinado con citoquinina para inducir la formación de callo en henequén. En la mayoría de los medios de cultivos ensayados, fue factible apreciar la formación de callo primario a partir de los 7 días de cultivo.
En la figura 1 se puede observar que, aunque la formación de callo con estructuras embriogénicas se indujo con ambas auxinas, el 2,4-D fue superior al Picloram, pues en presencia de éste se produjo el mayor porcentaje de explantes con callos con estructuras embriogénicas, lo que demostró significativamente su superioridad.
a, b, c, d, e Letras distintas difieren estadísticamente para p<0.05
Figura 1. Comportamiento del porcentaje de la formación de callos con estructuras embriogénicas en hoja de plántula de henequén cultivada in vitro.
En los resultados obtenidos con relación a las concentraciones de reguladores del crecimiento utilizadas, se encontró que la concentración en la que se produjo el mayor porcentaje de explantes con callo con estructuras embriogénicas fue la de 5,0 mg/L. Ello sugiere, que este género responde mejor a concentraciones inferiores o igual a 5,0 mg/L.
Con este resultado se evidencia que el 2,4-D fue la auxina más adecuada para inducir la formación de callo y la producción de agregados embriogénicos en henequén, lo que se corresponde con lo planteado por González, Alemán, Barredo y Robert (2002), de que esta es la auxina más utilizada y efectiva para la inducción de la embriogénesis somática en una gran cantidad de especies.
Se observó que en la superficie del corte del explante, a partir de las células meristemáticas, se formó una masa de tejido de aspecto translúcido, de color crema, nodular y muy friable, donde a los 60 días se evidenció la presencia de callo sobre todo el explante. Resultados similares se alcanzaron por Rodríguez-Garay et al., (1996) quienes lograron inducir la embriogénesis somática en la especie Agave victoria-reginae Moore por medio de embriogénesis directa a partir de la base de hojas de vitroplantas.
Está bien definido que el explante es el factor fundamental que incide en la respuesta embriogénica de diferentes especies (González, 2001), en este caso la concentración de 2,4-D también ocupa un lugar importante en la cadena de sucesos que definen la habilidad del cultivo bajo condiciones in vitro de responder a la formación de callos y su posterior diferenciación en órganos y/o embriones.
Teniendo en cuenta que la embriogénesis somática es un proceso eminentemente regulatorio, se ratifica en este ensayo la importancia de la concentración de auxinas para el crecimiento de los callos y la formación de los embriones. Algunas células en presencia de auxinas adquieren totipotencia, forman grupos proembriogénicos y pasan a la etapa globular.
Con estos resultados se evidencia que tanto el tipo de auxina como la concentración de la misma se relaciona estrechamente con la formación de los callos con estructuras embriogénicas en henequén, una posible respuesta puede estar dada, porque este tipo de regulador del crecimiento y su concentración afecta el tipo de división y la polaridad de la célula, mecanismos importantes en la formación de las células embriogénicas (De Jong, Schmidt y De Vries, 1993).
También se piensa, que la aplicación exógena de reguladores del crecimiento, probablemente modifiquen la polaridad celular por interferencia del gradiente eléctrico y del pH alrededor de las células (Smith y Kricorian, 1990). Por lo tanto, ello indica, la importancia que posee determinar el tipo y concentración del regulador del crecimiento adecuado, para inducir el proceso embriogénico.
Evaluación de indicadores del crecimiento en callos de henequén inducidos con altas concentraciones de auxinas
En la tabla 2 se puede observar que en la mayor concentración de 2,4-D se produjo el mayor valor de masa fresca la cual difirió estadísticamente del resto de los tratamientos. En todos los tratamientos con la presencia de 2,4-D se favoreció el incremento en masa fresca aunque estos valores no se diferenciaron de la mayor concentración de Picloram.
a, b, c, d Letras distintas difieren estadísticamente para p<0.05
Tabla 2 Efecto del tipo de auxina y concentración de esta sobre la producción de masa fresca en explantes de henequén.
La determinación de la masa fresca se establece como un buen indicador para evaluar el efecto de las auxinas en procesos fisiológicos ya que según Taiz y Zeiger (1998) este tipo de regulador del crecimiento favorece la adsorción o retención de agua la cual permite a la célula mantener su turgencia y con ello la eficiencia en su metabolismo.
Todo lo antes dicho se puede constatar con lo visto en la tabla 1 donde los mayores porcentajes de explantes con callo primario se alcanzan en las concentraciones de 2,4-D.
En la figura 2 se puede observar que la masa seca tuvo un comportamiento similar entre el control y las concentraciones de 2,5 y 5,0 mg/L de 2,4-D las cuales no se diferenciaron entre ellas pero si lo hicieron con relación al resto de los tratamientos. La mayor concentración de 2,4-D unido a los tratamientos con Picloram presentaron los valores más bajos de masa seca, los cuales no se diferenciaron estadísticamente.
a, b Letras distintas difieren estadísticamente para p<0.05
Figura 2. Efecto del tipo de auxina y concentración de esta sobre la producción de masa seca en explantes de henequén.
Lo anterior sugiere que el Picloram a las concentraciones utilizadas no favorece el incremento de masa seca aunque tampoco se aprecia el posible efecto estimulador del 2,4-D. A pesar de ello, en presencia de 2,4-D se produce el mayor porcentaje de callos con estructuras embriogénicas, respuesta que no aparece en el control.
Se debe señalar la importancia de los valores de masa seca como un indicador de calidad del tejido vegetal, pues ésta se compone principalmente de lignina y polisacáridos en la pared celular, además de componentes del protoplasma como proteínas, lípidos, aminoácidos, ácidos orgánicos y algunos elementos inorgánicos como el potasio (Castro y González, 2002).
El proceso de morfogénesis logrado en este ensayo no es más que el resultado de una organizada división y diferenciación celular con patrones definidos, que depende básicamente de la actividad y expresión de algunos genes. Este proceso está íntimamente relacionado con múltiples factores que son imposibles de definir aisladamente, ya que varían en dependencia de los tipos celulares, tejidos, especies y variedades (Ascon-Bieto y Talón, 2000).
Como fue posible comparar los efectos relativos de cada regulador del crecimiento utilizado, se puede plantear que el 2,4-D produjo los mejores resultados pues las diferencias encontradas en los medios con 2,4-D fueron relevantes al compararlas con aquellos que contenían Picloram.
Referencias bibliográficas
1. Ascon-Bieto, J y Talón, M. 2000. Fundamentos de Fisiología Vegetal. Ediciones Universitarias de Barcelona, España. 522p
2. Castro, R. D. y González, O. 2002. Eucalyptus (Eucalyptus grandis Hill ex Maiden) micropropagation in a temporary immersion system. AGRICULTURA TÉCNICA (CHILE) 62 (1):68 – 78.
3. De Jong, A.J.; Schmidt, E.D.L. y De Vries, S.C. 1993. Early events in higher-plant embryogenesis. Plant Mol Biol. 22: 367-377.
4. Garriga, M.; Alemán, S.y González, G. 2006. Influencia del estado físico del medio de cultivo y diferentes combinaciones de reguladores del crecimiento sobre la formación de brotes axilares en Agave fourcroydes Lem. Artículo Científico Biotecnología Vegetal Vol. 6, No. 1: 3 – 7, enero – marzo.
5. González, G.; Alemán, S.; Barredo, F. y Robert, M. 2002. Embriogénesis Somática en henequén. Revista Biotecnología Vegetal. Vol. 2. No 1. pp. 3-8, enero-marzo.
6. González, Oramas, G. 2001. Embriogénesis Somática en Henequén (Agave fourcroydes Lem.). Matanzas.117 h. Tesis (en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Agrícolas) Ministerio de Educación Superior.
7. Murashige, T. y Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15:473-497
8. Robert, M.; Herrera, J.; Chan J. y Contreras, F. 1992. "Micropropagation of Agave spp." In: Y.P.S. Bajaj, (ed.) Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol.19, Springer-Verlag, p. 306-329.
9. Rodríguez-Garay, B.; Gutierrez-Mora, A.; Acosta, B.A. 1996. Somatic embryogenesis of Agave victoriana reginae. Moore. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 4: p. 85-7
10. Smith, D. y Krikorian, A. 1990. Hormones in tissue culture and micro-propagation. [en línea]. Disponible en: . [Consulta: marzo 2009].
11. Taiz, L. y Zeiger, E. 1998. Plant Physiology. Sunderland, Massachussetts.
Autor:
Bover, Katia1;
katia.bover[arroba]indio.atenas.inf.cu
González, Gerardo2
Sosa del Castillo, Maryla2.
1 Estación Experimental de Pastos y Forrajes "Indio Hatuey". Central España Republicana. CP 44 280. Matanzas, Cuba.
2 Universidad de Matanzas "Camilo Cienfuegos"
Evento Fibratec 2010
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