Pesquisa de anticuerpos seroneutralizantes para pestivirus y herpesvirus en ovinos, caprinos y camélidos sudamericanos de Chile (página 2)

MATERIAL Y MÉTODOS

Muestras. Con el objeto de pesquisar un animal serorreaccionante, con una proporción esperada de muestras positivas de un 2%, con un 95% de confianza, se consideró un tamaño mínimo muestreal de 149 ovinos, 149 caprinos y 149 CS (Thrusfield, 1986). Las muestras obtenidas, mayoritariamente de sectores en donde, clínicamente, se sospechaba de la presencia del virus, se extrajeron por punción de la vena yugular, o de la herida de deguello en plantas faenadoras de carne, y fueron recibidas en frascos estériles. El suero se extrajo del coágulo sanguíneo por centrifugación a 3000xg por 10 minutos y se inactivó en un baño termorregulado, sometiéndolo a 56° C por 30 minutos, conservándose a 20 °C hasta el momento de realizar la prueba de seroneutralización.

Cultivos celulares. Se empleó la línea celular de cornete nasal bovino (Bovine turbinate cells. ATCC CRL-1390) cultivada en medio esencial mínimo adicionada de aminoácidos no esenciales, bicarbonato, "buffer" Hepes, combiótico y un 10% de suero equino como factor de crecimiento, el que fue rebajado a un 2% en el medio de mantenimiento celular.

Virus. Se emplearon las cepas de referencia, NADL del VDVB como pestivirus, y Los Angeles del VHB-1 como herpesvirus. La capacidad infectante, de cada una de las cepas, se determinó por dilución punto final, calculándose la dosis infectante cultivo de tejido 50% (DICT50) por el método de Reed y Muench (1938).

Prueba de seroneutralización. Se efectuó en microplacas de 96 pocillos, realizándose diluciones al doble en volúmenes de 50 ul, empleándose dos pocillos por dilución. A cada dilución de suero se adicionaron 50 ul de 200 DICT50 del virus respectivo. Paralelamente, se incluyeron sueros controles positivos (anti VDVB y anti VHB-1) y negativos, se realizaron controles de viabilidad celular, toxicidad de los sueros, unidades virales y título de la cepa viral. Las mezclas de suero-virus y controles se incubaron por 1 hora a 37° C y, posteriormente, se adicionaron 100 ul de una suspensión de 100.000 células por ml con un 20% de suero equino (Rossi y Kiesel, 1971). Las microplacas se controlaron diariamente, por observación microscópica, y el título dilución punto final seroneutralizante (DPFSN) del suero fue calculado por el método de Reed y Muench (1938). Con título DPFSN, igual o mayor a 2, el animal se consideró como seropositivo (Koptopoulos, 1992).

RESULTADOS

Se analizaron 321 muestras de ovino, 322 de caprinos y 199 de CS distribuidas en 74 alpacas, 43 llamas, 48 guanacos y 34 vicuñas. De las 842 muestras analizadas, en 95 (11,3 %) se detectaron anticuerpos DPFSN para pestivirus y en 70 (8,3 %) se detectó la presencia de anticuerpos DPFSN para herpesvirus, encontrándose seropositividad para pestivirus en ovinos, 18,7%, en caprinos 6,5%, en alpacas 10,8% y en llamas 14%. En guanacos y vicuñas no se detectaron anticuerpos para pestivirus (cuadro 1).

En relación a la serología para herpesvirus, la seropositividad fue en ovinos 2,5%, y en caprinos 19,3%. En alpacas, llamas, guanacos y vicuñas no se detectaron anticuerpos para herpesvirus (cuadro 1).

Se pesquisaron animales serorreaccionantes para pestivirus en ovinos de la Región Metropolitana y de la XII Región, en caprinos de la IV Región y de la Región Metropolitana, y en alpacas y llamas de la Región Metropolitana.

Para herpesvirus se pesquisaron animales serorreaccionantes en ovinos de la VI Región, y en caprinos de la IV Región y de la Región Metropolitana (cuadro 2).

DISCUSIÓN

La seropositividad detectada para las dos virosis, en este estudio, indican que los caprinos y ovinos se encuentran infectados con pestivirus y con herpesvirus y las alpacas y llamas con pestivirus.

Cabe hacer notar que las muestras de guanacos y vicuñas fueron obtenidas por captura de animales que se encontraban en su ambiente natural, y la ausencia de anticuerpos hace suponer, que en esas condiciones, estos animales no estarían infectados al menos con un pestivirus antigénicamente relacionado con la cepa NADL del VDVB ni con un herpesvirus antigénicamente relacionados con la cepa Los Angeles del VHB-1, no obstante ser ellos susceptibles de infectarse, dado su estrecho parentesco genético con los camélidos domésticos (alpacas y llamas). Esta situación es de especial relevancia ya que las dos virosis son causantes de serios problemas reproductivos en las especies donde ellas se han estudiado (bovinos, ovinos y caprinos) y de ser introducidas en estas especies silvestres, inmunológicamente desprotegidas, podrían provocar un gran impacto en la población.

Por otra parte, las alpacas y llamas ubicadas en la Región Metropolitana pertenecen a animales trasladados desde la I Región y los que registraron seropositividad llevaban mayor tiempo de permanencia y estaban en contacto con otras especies de rumiantes (ovinos y caprinos).

Según el número de animales serorreaccionantes, en las especies ovina y caprina, se destaca que los mayores porcentajes de positivos estuvieron para pestivirus en la especie ovina y para herpesvirus en la especie caprina (cuadro 1), lo que estaría señalando que, al parecer, existiría mayor predisposición de infección con pestivirus en ovinos que en caprinos y mayor predisposición de infección por herpesvirus en caprinos que en ovinos. Estas diferencias también fueron observadas por Howard y col. (1985), quienes encontraron en corderos un 6,4% de seropositivos para VDVB en 234 muestras analizadas, y un 0,4% de positivos para VHB-1 en 229 muestras analizadas. Al respecto, se ha podido comprobar que, por inoculaciones experimentales, las ovejas se infectan con VHB-1 y seroconvierten pero no diseminan fácilmente el virus (Hage y col., 1997).

A pesar de no ser este un estudio de prevalencia serológica, los resultados obtenidos a través de la pesquisa de anticuerpos, lo hace comparable a los reportados por otros estudios. En este caso, el porcentaje de seropositivos para pestivirus en ovinos varió desde un 7,1% hasta un 82,1%, detectándose un 22,7% de los rebaños infectados, resultado que es similar al obtenido por Tadich y col. (1998), donde los seropositivos para EB en ovinos de la X Región, empleando una prueba de ELISA, varió de 5,3% a 42,8% y encontró un 23% de las ovejerías seropositivas. Preliminarmente, Riedemann y col. (1991), en otro estudio de pesquisa de anticuerpos, detectó un 18% de seropositivos por prueba de neutralización para VDVB en ovinos de la X Región. En algunos rebaños seleccionados en Canadá se ha pesquisado un 0,9% de animales seropositivos con 20% de rebaños positivos (Heckert y col., 1994); en Francia la seropositividad para ovinos varió entre un 5 a un 85% y cerca del 30% de los rebaños ovinos fueron seropositivos y 10 al 30% de los rebaños caprinos tienen animales con anticuerpos (Russo y col., 1986, 1999).

Cabe hacer notar que en dos rebaños de la XII Región hubo un 66,7 % y 82,1% de infección, lo que podría estar denotando la existencia de un número considerable de animales PIT, ya que se atribuye la alta seroprevalencia de los rebaños a la presencia de infectados persistentemente (Lees y col., 1991).

Referente a los títulos de anticuerpos obtenidos, se observa que para pestivirus, en general, los títulos son más elevados que para herpesvirus. Al respecto, Howard y col. (1985) analizaron sueros de corderos por prueba de neutralización empleando la cepa Singer del VDVB y la cepa Colorado del VHB-1, y también detectaron diferencias en los rangos de títulos de anticuerpos para ambas virosis con valores <2 a >256 para VDVB y <2 a 2 para el VHB-1.

Se debe tener presente que, en este estudio, se emplearon cepas virales propias de la especie bovina (VDVB y VHB-1) y para ellas se describe una mayor relación antigénica entre VDVB y VEB que entre VHB-1 y VHO-1 y VHC-1. Si bien los caprinos pueden infectarse por VHB-1 y VHC-1, a pesar de que ambos virus presentan epitopes neutralizables comunes, la neutralización es en un sentido y el VHB-1 puede ser neutralizado más fácilmente por anticuerpos contra el VHB-1 que los producidos contra el VHC-1, a diferencia del VHC-1, que es neutralizable en igual medida por anticuerpos inducidos por VHB-1 y VHC-1 (Koptopoulus, 1992). Esto estaría señalando que la infección de los caprinos, de este estudio, sería más atribuible al VHB-1 que al VHC-1, ya que los títulos de anticuerpos oscilaron entre 2 y 45 y en infecciones por VHC-1 los títulos de anticuerpos han oscilado entre 8 y 128 (Neil y col., 1997). De todas maneras, la presencia de títulos neutralizantes de 2 o mayores indican infección por herpesvirus (Berríos y col., 1975; Horner y col., 1982; Koptopoulos, 1992).

Es preciso señalar que, en este estudio, todas las muestras seropositivas para herpesvirus (dado su bajo título) fueron nuevamente analizadas con la misma cepa viral pero disminuyendo de 100 a 10 las DICT50, con el fin de hacer menos exigente la prueba y confirmar la seropositividad de ellos. En todas las muestras procesadas la positividad se mantuvo y los títulos aumentaron en 0,5 a 1 dilución.

Respecto de la distribución geográfica, es destacable que los mayores serorreaccionantes se ubiquen para pestivirus en ovinos de la XII Región, y para herpesvirus en caprinos de la IV Región, lo que es de consideración por el rol que estarían jugando estos virus en estas zonas, dado que la producción ovina es el principal recurso ganadero que sustenta a la XII Región, como la producción caprina lo es para la IV Región, de tal modo que se hace necesario conocer el real impacto de estos virus en estas producciones en nuestro país.

Se confirma, a través de la detección de anticuerpos neutralizantes, que existe infección por pestivirus en ovinos, caprinos, alpacas y llamas en cautiverio, y que, los ovinos y caprinos están infectados por herpesvirus.

(*)Financiamiento: FONDECYT 1981193

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos la colaboración prestada por médicos veterinarios, ingenieros agrónomos y otros profesionales por el aporte de las muestras, que fueron fundamentales para realizar este estudio.

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