El teocintle es una gramínea, considerada como uno de los probables ancestros del maíz moderno, vive en la naturaleza, donde tolera estrés nutricional, hídrico, temperaturas extremas y el ataque de fitopatógenos. El teocintle como otras gramíneas, se asocia con bacterias con lo que interactúa en la rizósfera, en el rizoplano y en el interior de sus tejidos: raíz, tallos, hojas, etc. como endófitos.
El maíz es una gramínea doméstica cultivada normalmente bajo el sistema de producción intensiva, con altas dosis de fertilizante nitrogenado (FN), éste puede causar la pérdida de fertilidad del suelo, contaminación ambiental y elevar el costo de producción del maíz; una posible alternativa de solución para minimizar este problema, es la inoculación de la semilla del maíz, con bacterias endofitas del teocintle, que colonizan sus raíces, tallos, hojas, promueven su crecimiento a dosis reducida en un 50% menos urea o el equivalente a disminuir de 280 kg Nha-1 a 140 kgNha-1, de lo recomendado para la región del norte de Michoacán y sur de Guanajuato. Los objetivos de este trabajo fueron: i) aislar e identificar Burkholderia spp endófita del teocintle, y ii) determinar el efecto de la inoculación de Burkholderia spp sobre el crecimiento del maíz, a dosis reducida de urea en invernadero.
Por principio se determinó la densidad de la población de Burkholderia endófita en semillas, tallo-hojas y raíces del teocintle, por siembra de éstas partes de la planta, en agar Pseudomonas cepacia ácido azelaico triptamina (PCAT), posterior a su incubación, las bacterias se seleccionaron por su dominancia en comparación con su abundancia, en otras partes de la planta; como las raíces del teocintle. Las bacterias endofitas se caracterizaron en base a su perfil bioquímico, y las endofitas de raíz se inocularon en maíz sembrado en arena esterilizada, se registró como única variable-respuesta de la inoculación, el peso seco del maíz comparado con el maíz cultivado con la dosis recomendada para esa región.
Los resultados muestran Burkholderia spp endofitas, se detectaron en una densidad de 3.4 Log UFC/gramo de peso fresco (gpf), en raíz, de 3.0 Log UFC/gpf en semilla y en el tallo-hojas de teocintle, la Burkholderia sp, denominadas con las claves T41 y T42, se inocularon en maíz, el aislado T41 causó un incremento de un 47% en el peso seco de la raíz al amacollamiento y de un 57% a la extensión del tallo, comparados con el maíz sin inocular y con el nivel máximo de urea de 280 kg Nha-1. Parcialmente se concluye que el teocintle es una fuente de Burkholderia endófita benéfica para maíz.
Palabras clave: fijación biológica de nitrógeno, absorción radical, peso seco.
ABSTRACT
Teocintle is a wild gramine regarded as an ancestor of maize able to survive under nutritional and hydric stress, extreme temperature and phytopatogens attack. As a wild plant it is co-exists with bacteria on its rhizosphere, and its rizoplane, as well as host inside its tissues as an endophytes. On the other side, maize is a domestic plant cultivated under intensive yield system by using high levels of nitrogen fertilization (NF), which causes the loss of soil fertility, environmental pollution and increases its production cost. An alternative to solve this problem is to inoculate maize with plant promoting growth bacteria as these endophytes of teocintle at reduced levels of NF. The aims of this research were i) to isolate identify endophytic Burkholderia sp from teocintle and ii) to evaluate the inoculation effect of the endophyte Burkholderia sp on maize growth with and without nitrogen under greenhouse conditions. Population density of endophytic Burkholderia were isolated in seeds, stems and roots of teocintle by using Pseudomonas cepacia Azaleic Acid Tryptamin agar (PCAT). Burkholderia was inoculated in maize on sterile sand and dry weight was evaluated. Results showed that endophytic Burkholderia was detected at 3.4 UFC log/gram of fresh weight (gfw) in roots and at 3.0 log UFC/gfw in stems and roots. Burkholderia sp. T41 on maize grown without NF increased in 45% its root dry weight and 57% on stem length compared to non-inoculated maize, treated with high levels of NF as recommended. It is concluded that teocintle could be a source of beneficial endophytic Burkholderia spp to maize.
Key word: Biological nitrogen, radical absorption, dry weight.
El maíz es una de las gramíneas de mayor cultivo en México por sus múltiples usos, su producción en promedio es de 22×106 ton/año (Eubanks, 2001) el 50% se destina al consumo humano, para mantener su demanda, se emplea el sistema de producción intensiva, basado en el uso continúo del suelo, riego superficial, pesticidas y elevadas dosis de FN (Cárdenas-Navarro et al., 2005; Ferrera-Cerrato y Pérez-Moreno, 1995). Una posible alternativa de solución para racionar la aplicación de este FN, en la producción sustentable de maíz, es la inoculación de semillas a la siembra, con bacterias promotoras del crecimiento vegetal ó BPCV (Döberiener et al., 2001), porque cuando las semillas germinan, las BPCV colonizan las raíces de la planta, estimulan su crecimiento, mediante la síntesis de sustancias promotoras del crecimiento vegetal o fitohormonas como: el ácido-3-indol acético, que induce la proliferación de pelos radicales, con ello aumenta la absorción del FN a dosis reducidas de FN. El reto es la selección de BPCV competitivas y efectivas como inoculante biológico para el maíz a partir de gramíneas genéticas relacionadas, esto hace esperar una respuesta positiva y consistente del maíz a la inoculación con esas BPCV; no obstante la experiencia con las BPCV de ese origen, no es así (Bashan et al., 1996; Bashan y Levanony, 1990) en parte por factores bióticos como la competencia de la población nativa del suelo; por la predación por protozoarios y lisis de las BPCV causada por virus.
Mientras que los abióticos impiden la actividad de las BPCV por los cambios drásticos de temperatura, por la disponibilidad de agua y la carencia de nutrientes esenciales para su supervivencia, la suma de ambos factores evitan que las BPCV colonicen las raíces del maíz, en consecuencia se anula el efecto positivo sobre el crecimiento y rendimiento de la planta. Otro aspecto clave en la inoculación de BPCV en el maíz es su origen, normalmente este tipo de bacteria, proviene de otra gramínea doméstica, que no es necesariamente lo suficiente competitiva para dominar la rizósfera en la planta y ejercer su acción benéfica de promoción de crecimiento (Junior et al., 2000; Bashan et al., 1996).
Una alternativa poco explorada, es el empleo de BPCV endofitas del teocintle para la inoculación de maíz en especial por la estrecha relación genética entre ambas plantas (Galinat, 2001; Eubanks, 2001; Wilkes, 1972, 1997), este hecho supone una respuesta positiva del maíz a la inoculación con Burkholderia endófita del teocintle. (Nejad y Johnson, 2000; Sturtz y Nowak, 2000b; Sebilla et al., 2001).
El teocintle (Zea mays ssp mexicana), es una gramínea que crece en la naturaleza en suelos pobres en nitrógeno, en stress por sequía, tolera el ataque de fitopatógenos aéreos y de raíces (Sánchez y Ordaz, 1987; Wilkes, 1985) Burkholderia endófita del teocintle, ecológicamente tiene ventaja sobre las rizobacterias de plantas domésticas, por su estrecha interacción con los tejidos del maíz, en analogía con lo que se reporta en otras plantas, cultivadas y silvestres (Megalhaes-Cruz et al., 2001). Aun no esta definida la acción, por la que promueve el crecimiento del teocintle, en la literatura reporta efecto benéfico de estas endofitas en el crecimiento de plantas silvestres (Sturtz et al., 2000 a y b) y domésticas (Nejad y Johnson, 2000). Lo anterior se basa en el hecho de que existen por lo menos 54 géneros y 129 especies de bacterias endófitas que poseen algún mecanismo de promoción de crecimiento vegetal (Hallman et al., 1997 a,b,c; Mclnroy y Klopper, 1995 a y b; Sturz, 1995; Gardner et al., 1982; Mundt y Hinkle, 1976) en la literatura adémas se señalan otros géneros bacterianos de vida libre con especies endofitas de tipo: Pseudomonas, Bacillus, Enterobacter (Benhamou et al., 1996; Sharrock et al., 1991); actualmente Burkholderia y sus especies B. vietnamiensis en arroz (Gran Van et al., 2000); B. sp en piña (Weber et al., 1999) (Mattos et al., 2001) y B. brasilensis en algodón.
Las especies de Burkholderia inoculadas en gramíneas reportan que B. vietnamiensis en arroz aumentó en un 49% su peso radical, en comparación con el mismo cereal a la dosis de FN recomendada para la región, sin inocular en invernadero (Gran Van et al., 2000). B. vietnamiensis incrementó el peso seco del arroz por sustancias promotoras del crecimiento vegetal (SPCV) (Gillis et al., 1995; Tran Van et al., 2000). Burkholderia spp inoculada en arroz sin FN, causó un aumento de un 50% en el contenido de nitrógeno total; existe la hipótesis de que este incremento fue por la vía de la fijación biológica del N2 capacidad demostrada en esta especie de Burkholderia y por la medición de la actividad reductora de acetileno en el arroz (Megalhaes-Cruz et al., 2001). Existe el reporte que Burkholderia es un endófito en el sistema de conducción del arroz (Minerdi et al., 2001; Guillis et al., 1995; Mundt y Hinkle, 1976). En la actualidad la fijación biológica del N2, se considera una forma de promoción del crecimiento vegetal (Minerdi et al., 2001), otro ejemplo es B. brasilensis una endófita de caña de azúcar que causa un incremento del 25% en su rendimiento, por la vía de la fijación del N2 (Najad y Jonson, 2000), en comparación con la caña cultivada exclusivamente con el FN, sin inocular en este ensayo se detectó la actividad nitrogenasa de Burkholderia en los órganos de la gramínea (Mattos et al., 2001).
En general la investigación sobre la existencia y actividad benéfica de Burkholderia endófita en plantas domésticas, es amplía (Calderón-Becerra et al., 2000; Castellanos et al. 2005; Baldani et al., 1997; Hallman et al., 1997abc; Gardner et al., 1982), pero mínima en gramíneas silvestres, como el teocintle, tampoco existe información relacionada al efecto benéfico Burkholderia endófita de teocintle en el crecimiento del maíz, a dosis reducidas de FN desde un 50% menos de urea de lo recomendado para este cultivo, en la región norte de Michoacán y sur del bajío guanajuatense. Los objetivos de este trabajo fueron: i) Aislar e identificar Burkholderia endófita de raíces de teocintle benéficas para maíz ii) evaluar el efecto de la inoculación, de Burkholderia de teocintle en el crecimiento de maíz con y sin urea en invernadero.
a) Origen del teocintle (Zea mays sp mexicana L).
La gramínea se colectó de los municipios Sta. Ana Maya y Álvaro Obregón, ubicados en el noreste del estado de Michoacán a 35 km al noreste de Morelia, se le colectó creciendo en suelos franco-arcillosos, pobres en materia orgánica, en nitrógeno, en fosfato soluble, de pH 6.8, en estas zonas el teocintle es nativo.
b) Determinación de la densidad de Burkholderia endófita de teocintle.
Los aislados de Burkholderia se detectaron, en semilla, en las raíces y en el tallo-hojas, en la etapa 6, de la escala de Feekes ó de la extensión del tallo (Large, 1954) y en la etapa 11.4 ó del llenado del grano; para ello los órganos del teocintle se lavaron externamente con agua destilada y detergente comercial, se eliminaron los residuos del suelo de las raíces, luego cada tejido ó semilla, se desinfectó con hipoclorito de sodio al 3% (p/v) por 15 min, se lavaron 6 veces con agua esterilizada, después se trataron con tween 20, al 2% (v/v) por 5 min, se lavaron 6 veces con agua esterilizada, finalmente se desinfectaron en etanol al 70% por 5 min y se lavaron 3 veces en agua esterilizada, la eficacia de la desinfección de los tejidos y semillas del teocintle, se comprobó mediante su siembra en agar nutritivo (Bioxon) e incubación a 28 -30 °C por 24 h; de cada órgano o tejido de teocintle se pesó un gramo y se trituró por separado en un mortero en solución salina (NaCl 0.85%) esterilizada, se inició con la dilución 10-1 del macerado y las siguientes en serie: 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, se determinó la densidad de la población de Burkholderia endófita; de la dilución más alta 10-6 se tomó 0.1 ml para sembrar en caldo Watanabe (W) medio mineral sin nitrógeno, empleado para la prueba indirecta de fijación biológica de N2, preparado de acuerdo con la siguiente fórmula: Solución A (g/L): Zn SO4, 7H2O, 0.43; Mn SO4, H2O, 1.30; NaMoO42H2O. 0.75; H3 BO3, 2.8; Cu SO4 5H2O, 0.026; Co SO4 7H2O, 0.07; Solución B (g/L): Mn SO4 7H2O, 2.00; Ca Cl2 2H2O, 2.00; Fe SO4 7H2O, 0.44; EDTA 0.04. Solución C (g/1): K2HPO4, 60; KH2PO4 60; mezclar solución B 50 mL, solución C 15 mL y solución A 20 mL / L; se agregó por separado (g/L): glucosa 5; sacarosa 4.5; manitol 3.5; almidón 4; el pH se ajustó a 6.8 – 7.0; se esterilizó a 121 °C por 15 min para el aislamiento de Burkholderia endófita, se empleó el agar Pseudomonas cepacia ácido ázelaico triptamina ó PCAT (g/L): Mg SO4, 0.1; ácido ázaleico 0.20; triptamina 0.2g (disolver en 2 mL de alcohol absoluto): K2HPO4 4; KH2PO4 4; extracto de levadura, 0.02; el pH se ajustó a 5.7; las cajas de PCAT se incubaron a 28-30 °C por 72 h; las cajas con Watanabe se incubaron por 48 h; los aislados endofitos de teocintle que crecieron en estos medios de cultivo, se resembraron en agar nutritivo para asegurar su pureza (Calderón-Becerra et al., 2000).
Identificación de Burkholderia endófita de raíces del teocintle.
Los aislados Burkhoderia endofita de raíces del teocintle se identificaron, por su perfil bioquímico que se muestra en el cuadro 1, según se describe en la literatura (Mattos et al., 2001 y Calderón Becerra et al., 2000), se incluyó el sistema API-50CH (BioMerieux, Francia), Burkholderia endófita de las raíces del teocintle, se compararon con las cepas de referencia: B. cepacia ATCC 2546 y B.vietnamiensisTVV75; donadas por el Dr. J. Balandreu y el Dr. Tran Van Van, del Depto de Ecología Microbiana de Suelos de la Universidad Claude Bernard, Lyon, Francia, además de las pruebas bioquímicas indicadas en el cuadro 2 que se relacionan con este género, referente a su capacidad de utilizar diversas fuentes de carbono.
Medición indirecta de capacidad de Burkholderia para la fijación biológica de N2.
Los aislados de Burkholderia endófita de las raíces del teocintle, según las pruebas bioquímicas, se suspendieron en solución salina para inocular matraces Erlenmeyer de 500 mL con 250 mL de caldo Watanabe; estos matraces se incubaron de 28-30 °C; se tomaron alícuotas a intervalos de 24, 48, 72 y 96 h, con el método de Lowry para cuantificar la cantidad de proteína, medida indirecta del crecimiento de la bacteria al fijar N2 (Sebilla et al., 2001.)
Inoculación de maíz con Burkholderia endófita en invernadero.
En este ensayo se usaron semillas de maíz "raza jala", donadas por Laboratorio de Química de Productos Naturales de La Escuela de Químico-Farmacobiología de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Las semillas se pasteurizaron sumergidas en agua a 70°C por 5 min, para eliminar las bacterias endófitas que contienen según lo reporta en la literatura (Hallman et al., 1997abc); luego las semillas se colocaron en hielo por 5 min, se desinfectaron acorde con el procedimiento señalado en el punto b), para aislar las bacterias endofitas de tejidos y órganos vegetales.
Para el experimento del efecto de Burkholderia en maíz se sembraron 5 semillas del maíz en maceta de plástico con capacidad de 4 kg, en arena húmeda esterilizada a 121°C / 60 min / 3 días; cuando las semillas germinaron se inocularon 3 mL de Burkholderia de teocintle, a la densidad de 1×10 3 log UFC/ semilla; después de germinar se dejaron 2 plantas de maíz por maceta; la superficie de estas se cubrió con aserrín esterilizado a 121°C / 2 h; las macetas del maíz se mantuvieron en invernadero, se irrigó 3 veces por semana con la solución mineral Thorton, esterilizada a 121°C por 15 min (g/L): K2HPO4, 0.2; Mg SO4H2O, 0.2; NaCl, 0.1; Fe2 SO4, 0.01 y mL de elementos menores CuSO4 1 mL; solución 1M de: ZnCl2, 0.22, NaMoO4, 1 mL/L (García et al., 1995).
Diseño experimental y esquema de fertilización nitrogenada.
En el ensayo de inoculación de maíz con Burkholderia se emplearon los siguientes tratamientos: Control relativo (C) = maíz sin inocular y con 280 KgNha-1 equivalente a la dosis 100% de urea recomendada para la región, variedad jala de maíz; tratamiento 1: B. sp 1 y ½, 50% de la dosis de urea ó 140 kg/Nha-1; tratamiento 2: B.2 1/2 = maíz inoculado con B. sp 2 y 50% de urea; tratamiento 3: B.2 1/2 = maíz inoculado con B. sp 2 y ½, 50% de la dosis de urea ó 140 kg/ha-1. El diseño se realizó con 20 repeticiones por tratamiento, la distribución del maíz en el invernadero fue un diseño de bloques completamente al azar, se hicieron dos muestreos: el primero al amacollamiento según la escala Feekes (Large, 1954), el segundo a la extensión de tallo, en cada muestreo se separaron las raíces y el tallo para secar a 80 °C / 24 h y determinar su peso seco.
Análisis estadístico.
Los resultados obtenidos se sometieron a la prueba de Tukey, con base en un diseño de 5 tratamientos y 20 repeticiones, para evaluar el efecto de Burkholderia endófita, sobre el peso seco del maíz; las diferencias en la respuesta de la planta por tratamiento, se establecieron por comparación de medias, con la prueba de la diferencia mínima significativa (DMS) y con un nivel de significación de P<0.05. Los cálculos se realizaron con el programa para computadora Statgrat versión 5.0 (2002).
La figura 1 muestra en general que la población endófita de Burkholderia en la semilla, en el tallo-hojas y en especial en las raíces del teocintle, en donde se le detectó en un orden de magnitud de 3.4 log UFC/gpf (gramo de peso fresco); de 3.0 log UFC/gpf en el tallo-hoja y en semilla, se estableció una diferencia estadística significativa entre la población de Burkholderia en raíces y la detectada en los tejidos aéreos de teocintle, esto sugiere una distribución heterogénea de este género bacteriano en la planta, como se reporta para otros endofitos de especies vegetales domésticas (Benhamov et al., 1996, Sharrock et al., 1991) y silvestres diferentes al teocintle, la literatura señala que Burkholderia es endófita en una amplia variedad de plantas, en las que promueve su crecimiento (Nejad y Jonson, 2000; Sturz, 1995; Sturz y Nowak, 2000; Sebilla et al., 2001). Burkholderia endófita se distribuyó heterogéneamente en sus órganos, en especial en las raíces, por ello los endófitos inoculados en el maíz para el ensayo en invernadero fueron de las raíces del teocintle.
Los valores son el promedio de 1 g de semillas, y posteriormente de 20 plantas. Valores con la misma letra sin diferencia estadística. (DMS P<0.05) según Tukey, 1 g= semilla, tallo y raíz.
Identificación bioquímica de los endofitos de teocintle.
En el cuadro 1 se muestra el perfil bioquímico de los endofitos, aislados de las raíces del teocinte. La literatura reporta que Burkholderia sintetiza citocromo oxidasa, y que posee un patrón oxidativo en la utilización de azúcares. Este género se describe como un bacilo Gram Negativo, móvil, catalasa y oxidasa positivo, no produce ácido sulfihídrico, ni triptofanasa; crece en medio mineral sin nitrógeno; usa el citrato de sodio como única fuente de carbono y no libera ácido de glucosa, en este cuadro se muestran las diferencias bioquímicas básicas entre Burkholderia endófita de las raíces del teocintle y el género Pseudomonas spp, aislada de plantas silvestres (Valdivia-Urdiales et al., 1999), en el anterior patrón permite su separación taxonómica por su perfil bioquímico, como lo reportan Baldani et al., (1997) y Gillis et al., (1995), con una certeza de aproximadamente de un 80% de pertenencia al género Burkholderia.
Cuadro 1. Comparación entre el comportamiento bioquímico de Burkholderia endófita del teocintle y Pseudomonas de plantas domésticas y silvestres.
Prueba | Burkholderia spp | Pseudomonas spp |
Gram | – | – |
Movilidad | + | + |
Oxidasa | + | + |
Catalasa | + | + |
Arginina desaminasa | – | + |
Ureasa | + | – |
Indol (Triptofanasa) | – | – |
Producción de H2S | – | – |
Rojo de metilo | + | + |
Crec. sin N comb*. | + | + |
Asimilación de: Ácido azelaico Triptamina Citrato de sodio | + + + | – – + |
Fermentación de: Glucosa Lactosa Sacarosa Manitol | – – – – | – – – – |
Respuesta a Polimixina | R | S |
Reacción= (+)= positiva y (-)= negativa; (R)= resistente; (S)= sensible, *Crec. sin N comb.= crecimiento en medio mineral sin nitrógeno. Cada prueba se realizó por triplicado.
El cuadro 2 se muestra el patrón de asimilación de 50 carbohidratos de los aislados endófitos de las raíces del teocintle denominadas: T421 y T42, en comparación con las cepas de referencia: B. cepacia ATCC 25416 y B. vietnamiensis TVV 75 que asimilaron: acetato, D-α-alanina, succinato, 2-ceto-gluconato, celobiosa, D-arabinosa, D-arabitol, D-fructuosa, D-glucosa, D-lisosa, D-manosa, D-tagatosa, dulcitol, D-xilosa, esculina, galactosa, glicerol, gluconato, inositol, D-arabinosa, D-fucosa, manitol, N-acetil glucosalina, ribosa, sacarosa, sorbitol. Pero no α-metil D-glucosida, α-metil D-manosida, almidσn, β-metil xilosa, ramnosa, melizitosa, melibiosa, maltosa, lactosa, erytriol, L-sorbosa. B. vietnamiensis TVV75 y B. sp T42; sólo usaron β-gentobiosasola y D-fucosa. B. cepacia y B. sp T41 y T42; arabutina B. cepacia; D-arabitol; B. vietnamiensis; turanosa. B. sp T41; salicilina. B. spp T41 y T42; glucogéno e inulina. Estos datos son útiles para el diseño de medios de cultivo selectivos, en el aislamiento y diferenciación de especies de Burkholderia de diversos ambientes.
Los aislados sospechosos de Burkholderia endófita de las raíces del teocintle: T41 y T42, mostraron un patrón de asimilación de azúcares y sus derivados, similar al reportado por Gillis et al., (1995). Lo que apoya que pertenecen a este género y sólo requieren una confirmación molecular, para su clasificación definitiva en este género.
Cuadro 2. Asimilación de diferentes fuentes de carbono orgánico, de Burkholderia endófita de las raíces del teocintle.
Fuentes de carbono | ||||||||||||||
* | ** | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | ||
Cepas de referencia | B.cepacia ATCC 25416 | + | – | – | + | + | + | + | – | – | – | – | + | – |
B. vietnamiensis TVV 75 | + | – | + | – | – | – | – | + | + | + | – | – | – | |
BET | B. spp T41 | + | – | – | + | – | + | – | + | – | – | + | + | + |
B. spp T42 | + | – | + | – | + | + | – | – | + | – | + | – | + | |
*Acetato, D-α-alanina, succinato, 2 ceto gluconato, celobiosa, D-arabinosa, D- arabitol, D-fructusa, D-glucosa, D-lisosa, D-manosa, D-tagatosa, dulcitol, D-xilosa, esculina, galactosa, glicerol, gluconato, inositol, D-arabinosa, D, fucosa, manitol, N-acetil glucosalina, ribosa, sacarosa, sorbitol, fueron asimilados
**α-metil D-glucosida, α-metil D-manosida, almidσn, β-metil xilosa, ramnosa, melizitosa, melibiosa, maltosa, lactosa, erytriol, L-sorbosa, glucogeno, inulina. 1=β-gentobiosa, 2=Adonitol, 3=Amigdalina, 4= Arabutina, 5=D-arabitol, 6=D-fucosa, 7=D-rafinosa, 8= Turanosa, 9=Inulina, 10=Salicilina, 11= glucogeno. Reacción observada: (+) = asimilado, (-)=no asimilado
BET= Burkholderia endofita de teocintle.
En la figura 2 se muestra el crecimiento de las cepas de referencia: B. cepacia ATCC 25416, B. vietnamiensis TVV 75, comparadas con Burkholderia sp T41, T42 y S37 endófitas del teocintle, crecidas en Watanabe sin nitrógeno en el que se registró que B. vietnamiensis TVV75 creció en 24 h, en contraste con B. spp T41 que lo hizó en 48 h mientras B. sp T42 en 72 h, la concentración de proteína usada como medición indirecta del crecimiento bacteriano, el cual fue equivalente al registrado en la cepas de Burkholderia de referencia que crecieron, sin limitación de nitrógeno, esto sugiere fijación de N2 en evidente diferencia, con el mínimo crecimiento de B. cepacia ATCC 25416 y B. spp S37 que no generaron proteína en el caldo Watanabe, en concordancia con la literatura que no reporta que B. cepacia, no fija el N2, a diferencia B. vietnamiensis TVV75 que si fija N2 (Gillis et al., 1995; Tran Van Van et al., 2000). La concentración del total de la proteína por B. sp T41 y T42 endófitas de las raíces del teocintle, acumulada en el caldo Watanabe apoya que fijan N2, no obstante su perfil bioquímico no corresponde a B. vietnamiensi, lo que indica que pertenecen al género Burkholderia, pero no a la especie B. vietnamiensis.
Figura 2. Crecimiento de los aislados del teocintle y las cepas de referencia de Burkholderia en caldo Watanabe medida indirecta de la fijación biológica del N2.
Todos los valores son el promedio de 20 repeticiones. CV 15%.
Inoculación de Burkholderia endófita de raíces del teocintle en maíz en invernadero.
En la figura 3 se muestra el efecto de la inoculación de Burkholderia sp T41 endófita de teocintle, aumentó en un 47%, sin urea en el peso seco radical del maíz, al amacollamiento, mientras que con 140 kg/N/ha-1 de urea ó el 50% de la dosis, el peso seco del maíz fue de un 25% mayor, en comparación con el similar del maíz usado como control relativo sin inocular y fertilizado con 280 kgN/ha-1 de urea o la dosis 100%. Estos datos apoyan que el aislado de Burkholderia T41 tuvo un efecto positivo de promoción de crecimiento vegetal en el maíz (Fuentes-Ramírez et al., 1999) B. sp T42 endófita de las raíces del teocintle, causó un incremento del 11% en el peso seco del tallo de maíz sin urea; mientras hubo un incremento del 14% del peso seco del maíz tratado con 140 kgN/ha-1, dosis del 50% de urea, comparado con el porcentaje del peso seco del maíz usado como control relativo sin inocular con 280 kgN/ha-1 equivale a la dosis 100% de urea.
El tipo de respuesta del maíz a la inoculación con Burkholderia endofita de teocintle, sugiere que la bacteria fija N2, pues esa actividad en los procariotes en asociación con vegetales, es dependiente de la concentración del FN disponible para la planta (Döbbereiner et al., 2001), en acuerdo con lo que la literatura señala sobre B. vietnamiensis y otras bacterias fijadoras de N2 (Hallmann et al., 1997b), cuando viven en asociación con gramíneas en las que ejercen un efecto benéfico de promoción sobre su desarrollo y rendimiento a dosis reguladas de FN. (Minerdi et al., 2001; Sturtz et al., 2000a).
O. maíz sin inocular, Aislados: B1: Burkholderia sp T41, B2: B. sp T42, Dosis de urea: (1); 280 KgN h-1, (1/2); 140 KgNh-1, (0); con 0 KgNh-1. La medida corresponde a 20 repeticiones. Valores con la misma letra sin diferencia estadística significativa (P<0.05) según Tukey.
En la figura 4, se muestra el efecto de Burkholderia endófita de las raíces del teocintle, sobre el peso seco del tallo del maíz durante la extensión del tallo; en donde B. sp T41 lo incrementó en un 57%, sin urea y en un 39% con 140 kgN/ha-1 ó el 50% de la dosis; similar al porciento en peso seco observado en el maíz fertilizado con 280 kgN/ha-1 equivalente a la dosis 100% de urea, sin inocular, mientras B. sp T42 en maíz causó un aumentó del 18% del peso seco del tallo, sin FN; y un 16% en el peso seco del maíz con 140 kgN/ha-1 equivalente a la dosis 50% de urea, similar al valor de esa variable-respuesta en el maíz usado como control relativo, tratado con 280 kg/N ha-1 dosis 100% de urea, sin inocular, se hipotiza que cuando no se aplicó urea Burkholderia del teocintle fijaron N2, como se reporta sucede cuando este género bacteriano, se asocia con arroz a dosis mínimas de FN ó sin N (Hallmann et al., 1997b).
El efecto positivo Burkholderia teocintle sobre el maíz, fue análogo reportado por Sebilla et al., (2001), con A. diazotrophicus inoculado en caña de azúcar sin FN en invernadero, en este ensayo se reportó que la bacteria aumentó en un 50% el contenido de nitrógeno en la planta, respuesta similar de la caña fertilizada con la dosis 100% de urea, sin inocular (Fuentes-Ramírez et al., 1999), también se observó que el efecto benéfico de Burkholderia sobre el maíz se inhibió con la de concentración de urea, acorde con lo señalado en la literatura cuando se inocula una bacteria endofita del tipo A. diazotrophicus en gramíneas a dosis relativamente elevadas de FN (Sturtz y Nowak, 2000b).
Burkholderia endofita de teocintle causó un incremento en el peso seco de tallo de maíz, que fue dependiente del origen del aislado, ya que B. T41 causó un positivo efecto mayor que B. sp T42, cuando se compararon ambos con el peso seco del tallo del maíz, usado como control relativo y fertilizado con 280 kg Nha-1 equivalente a la dosis 100% de urea, sin inocular (Junior et al., 2000). El aislado de B. spp T41 de teocintle causó el mayor efecto positivo en el peso seco del tallo del maíz, sin urea (Sturtz et al., 2000a). en contraste con B. sp T42 que incrementó en un 20% el peso seco del tallo, independiente de la dosis de urea aplicada, hecho para el cual aun no se tiene una explicación, ya que en general en la literatura se reporta que dosis relativamente elevadas de FN, inhiben el efecto positivo de A. diazotrophicus en caña de azúcar (Hallman et al., 1997c), lo cual se registró en este ensayo con Burkholderia en maíz con la dosis máxima de urea que inhibió el efecto positivo de B. sp T41 en el peso seco del tallo del maíz (Fuentes-Ramírez et al., 1999), no obstante que este patrón bacteria -dosis de FN, suceso que no se reporta en Herbaspirillum spp (Junior et al., 2000), el cual fue análogo a lo observado con B. sp T42. Estos datos sugieren que los aislados indica que Burkholderia del teocintle, no pertenecen a la misma especie, pues la literatura al respecto (Fuentes–Rámirez et al., 1999) indica que la conversión de productos del metabolismo vegetal en bacterias endofitas, en SPCV, es función no sólo del género, sino también de la especie bacteriana en asociación con una familia vegetal específica (Gardner et al., 1982; Nejad y Jonson, 2000).
Figura 4. Efecto de inoculación de las probables Burkholderia spp endofitas de las raíces del teocintle, sobre el peso seco del tallo de maíz con y sin urea en invernadero
O. maíz sin inocular, Aislados: B1: Burkholderia sp T41, B2: B. sp T42, Dosis de urea: (1); 280 KgN h-1, (1/2); 140 KgNh-1, (0); con 0 KgNh-1. La medida corresponde a 20 repeticiones. Valores con la misma letra, sin diferencia estadística significativa (P<0.05) según Tukey.
En los órganos del teocintle especialmente en las raíces, en el tallo-hojas y en las semillas en ese orden se detectó endófita Burkholderia, su perfil bioquímico sugiere que no se trata de Burkholderia vietnamiensis. El endofito de teocintle fue benéfico para el crecimiento del maíz, independientemente de urea aplicado.
Este trabajo es uno de los primeros reportes sobre la asociación del género Burkholderia endófita de las raíces, del tallo-hojas, de la semilla del teocintle.
Agradecimiento. Al Proyecto 2.7 (2003-2005) de la CIC-UMSNH por el apoyo y facilidades para su publicación, a Beatriz Noriega-Gamboa por su trabajo de escritura.
Baldani, VDL., Olivera, E., Balota, E., Baldani, J.I., Kirchhof, G, and Dobereiner, J. 1997. Burkholderia brasilensis sp. nov. Especie de bacteria diazotrófica endofítica. An Acad. Brasil Ci. 69: 116.
Bashan, Y. and Levanony, H. 1990. Current status of Azospirillum inoculation technology: Azospirillum as a challenge for agriculture. Can. J. Microbiol. 36: 591-608.
Bashan, Y., Holguín, G, y Ferrera, R. 1996. Interacción entre plantas y microorganismos benéficos. I. Azospirillum. Terra. 14: 159-194.
Benhamou, N., Kloepper, J.W., Quadt-Hallman, A. and Tuzun, S. 1996. Induction of defense-releated ultrastructural modification in pea root tissues inoculated with endophytic bacteria.
Plant Physiol. 112: 919-929.
Castellanos VC; Farias-RR; Cárdenas N.R; Villegas M.J. and Sánchez Yánez, J.M. 2005 Bulkholderia an endophytic bacteria of Teocintle (Zea mays sp mexicana L) Phyton (In press) Calderón-Becerra, MA., Balandreau, J. y Sánchez-Yáñez, J.M. 2000. Bacterias fijadoras de nitrógeno asociada a las raíces de teocintle (Zea mays sp mexicana L) y maíz (Zea mays L). Cuatro Vientos. 16: 4-12.
Cárdenas-Navarro, R., Peña-Cabriales, J.J., Farías-Rodríguez, R. y Sánchez-Yáñez, J.M. 2005. Los aportes del nitrógeno en la agricultura. Revista Horticultura. (en prensa).
Döbberiener, J., Croonenborghs, A. Thys, A., Ptacek, D., Vanderleyden, J., Dutto, P., Labandera-González, C., Caballero-Mellado, J., Aguirre, J.F., Kapulnik, Y., Brener, S., Burdman, S., Kadouri, D., Sarig, S, and Okon, Y. 2001. Responses of agronomically important crops to inoculation with Azospirillum. Autr. J. Plant Physiol. 28:871-879.
Eubanks, M.W. 2001. The mysterious origin of maize. Economic Botany. 4:492-514.
Ferrera-Cerrato, R, y Pérez-Moreno, J. 1995. Agromicrobiología, elemento útil en la agricultura sustentable. Colegio de Postgraduados en Ciencias Agrícolas, Montecillo, Estado de México. pp: 36-50.
Fuentes-Ramírez, L.E., Caballero-Mellado, J., Sepúlveda, J, and Martínez-Romero, E. 1999. Colonization of sugarcane by Acetobacter diazotrophicus by high fertilization. FEMS. Microbiol. Ecology: 1-11.
García, G.M.M., Peña-Cabriales, J.M., Moreno, M.P., Sánchez-Yáñez, J.M. 1995. Inoculación de maíz con bacterias fijadoras de N2. TERRA 13:71-80.
Galinat, W.C. 2001. A reconstruction of a possible role of crucial observations leading to a rapid domestic transformation of wild teosintle into the first maize. Economic Botany 4:571-574.
Gardner, J.M., Feldman, A.W, and Zablotowicz, R.M. 1982. Identity and behavior of xylem-residing bacteria in rough lemon roots of Florida citrus trees. Appl. Environ Microbiol. 43: 1335-1342.
Gillis, M., Van, T.V., Bardin, R.,Goor, M., and Heebar, P. 1995. Polyphasic taxonomy in the genus Burkholderia leading to an amended description of the genus and proposition of Burkholderia vietnamiensis sp.nov. for N2-fixing isolates from rice in Vietnam. Int. J. Syst. Bacteriol. 45:274-289.
Hallmann, J., Quadt-Hallmann, A., Mahaffee, W.F, and Kloepper, J.W. 1997b. Bacterial endophytes in agricultural crops. Can. J. Microbiol. 43:1997.
Hallmann, J., Kloepper, J.W, and Rodríguez-Kábana, R. 1997c. Aplication of the Scholander pressure bomb to studies on endophytic bacteria of plants. Can J. Microbiol. 43: 411-416.
Halmann, J., Quadt-Hallmann, A., Rodríguez-Kábana, R, and Kloepper, J.W. 1997a. Endophytic rizobacteria as antagonists of Meloidogyne incognita on cucumber. Phytopatology. 85: 1136.
Junior, F.B.D., Reis, V.M., Urquiaga, S. and Döbereiner, J. 2000. Influence of nitrogen fertilization on the population of diazotropic bacteria Herbaspirillum spp and Acetobacter diazotrophicus in sugar cane. Plant Soil. 219: 153-159.
Large, E.C. 1954. Growth stages in cereals, illustration of the Feekes scale. Plant Pathol. 3: 128-129.
Megalhaes-Cruz, L., Maltempi de Souza, E., Weber, OB., Baldani, J.I., Dobereiner, J, and Oliveira-Redroza, F. 2001. 16 S Ribosomal characterization of nitrogen-fixing bacteria isolated from banana (Musa spp) and pinapple (Ananas comosus L). Appl. Environ. Microbiol. 67:2375-2379.
Mattos, K.A., Jones, C., Heise, N., Previsto, J.O. and Mendoca-Previato, L. 2001. Structure of an acidic exopolysaccharide produced by the diazotrophic endophytic bacterium Burkholderia brasilensis. Eur. J. Biochem. 268: 3174-3179.
McInroy, J.A., and Kloepper, J.W. 1995 b. Population dynamics of endophytic bacteria in field-grown sweet corn and cotton. Can. J. Microbiol. 41: 895-901.
McInroy, J.A. and Kloepper, J.W. 1995a. Survey of indigenous bacteria endophytes from cotton and sweet corn. Plant. Soil. 173: 337-342.
Minerdi, D., Fani, R., Gallo, R., Boarino, A, and Bonafante, P. 2001. Nitrogen fixation genes in an endosymbiotic Burkholderia strain. Appl. Environ. Microbiol. 67: 725-732.
Mundt, J.O. and Hinkle, N.F. 1976. Bacteria within ovules and seed. Appl. Environ. Microbiol. 32: 694-698.
Nejad, P., and Johnson, P.A. 2000. Endophytic bacteria induce growth promotion and wilt disease suppression in oilseed rape and tomato. Biol. Control. 18: 208-215.
Sánchez, G.J.J, and Ordaz, L. 1987. Teocintle in México systematic and ecogeographic studies on crop genepools. Rome: IBPGR.
Sebilla, M., De Oliveira, A., Baldani, I, and Kennedy, C. 2001. Contributions of the bacterial endophyte Acetobacter diazotrophicus to sugarcane nutrition: A preliminary study. Symbiosis. 25:181-191.
Sharrock, K.R., Parkes, S.L., Jack, H.K., Rees-George, J, and Hawthorne, B.T. 1991. Involvement of bacteria endophytes in storage rots of buttercup squash (Cucurbita maxima). Crop. Hortic. Sci. 19:157-165.
Sturtz, A.V. 1995. The role of endophytic bacteria during seed piece decay and potato tuberization. Plant. Soil. 175: 257-263.
Sturtz, A.V. and Nowak, J. 2000b. Endophytic communities of rhizobacteria and the strategies required to create yield enhancing association with crops. Appl. Soil. Ecol. 15:183-190.
Sturtz, A.V., Christie, B.R, and Nowak, J. 2000a. Bacterial endophytes: potential role in developing sustainable systems of crop production. Cri. Rev. Plant Sci. 19:1-30.
Tran Van, V., Berge, O., Ngo Ke, S., Balandreau, J, and Heulin, T. 2000. Repeated benefical effects of rice inoculation with a strain of Burkholderia vietnamiensis on early and late yield components in low fertility sulphate acid of Vietnam. Plant Soil. 218:273-284.
Valdivia-Urdiales, B., Peña-Cabriales, R.J., Fernández-Brondo, J.M. y Sánchez-Yáñez, J.M. 1999. Efecto de la coinoculación con Glomus spp y Pseudomonas putida en trigo. Rev. Lat. Microbio. 41:231-237.
Weber, O.B., Baldani, V.L.D., Teixeira, K.R.S., Kirchhof, G., Baldani, J.I, and Dobereiner, J. 1999. Isolation and characterization of diazotrophic bacteria from banana and pineapple plants. Plant Soil. 210: 103-113.
Wilkes, H.G. 1972. Maiz and its wild relatives. Science. 177:1071-1077.
Wilkes, H.G. 1997. Hibridization of maize and teocintle in Mexico and Guatemala and improvement of maize. Econ. Bot. 31: 254-293.
Wilkes, H.G. 1985. Teocintle: the closest relative of maize revised Maydica. 30:209-223.
García-Reyna, M.J1,
Farias R. Rodolfo+
Sánchez-Yáñez, J.M.1*
*autor correspondiente
.
+Ecología microbiana. Microbiología Ambiental
1.. Instituto de Investigaciones Químico-Biológicas. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo.
Morelia. Mich., México.