Técnicas espectrofotométricas de absorción ultravioleta-visible (página 2)

Transmitancia: fracción de radiación que una sustancia deja pasar cuando la REM atraviesa la muestra. Transmitancia = T = P/P0 T puede valer desde 0 hasta 1. %T puede valer desde 0 hasta 100 % Absorbancia: es la atenuación de la intensidad de la radiación cuando ésta incide sobre una muestra. Es la cantidad de energía que la sustancia toma para pasar a un estado más excitado. A aumenta a medida que aumenta la atenuación de la radiación. Cuando no hay absorción de radiación Po= P y entonces A = 0,, mientras que si se absorbe el 99% de la radiación, solo se transmite el 1%, la A = 2

Transmitancia y absorbancia Absorbancia = – log T = log P0 /P 13 3. Fundamento de la Espectrofotometría de Absorción UV-visible

Un espectro de absorción es una representación gráfica de la absorbancia de un analito (o de otra magnitud equivalente) en función de la longitud de onda de la radiación ? (o de otro parámetro relacionado con la energía de la radiación utilizada).

El máximo de absorbancia obtenido en el espectro de absorción de un analito, nos dará la longitud de onda que proporciona la mayor sensibilidad posible, y por tanto será la que se utilizará en el análisis espectrofotométrico de dicho analito. Espectros de absorción (Gp:) Absorbancia A (Gp:) ? nm

?max 14 3. Fundamento de la Espectrofotometría de Absorción UV-visible

La sensación de color se produce cuando disminuye apreciablemente una o más zonas de la región visible.

Si el ojo recibe luz de todas las ? de la región visible el efecto es luz blanca.

El color aparente siempre es el color complementario del que ha sido eliminado.

Los colores complementarios son útiles para predecir la ? de absorción de los compuestos coloreados: una disolución amarilla, absorberá luz azul 450-480 nm, para analizarla debemos usar luz con esta ? seleccionada con el monocromador o bien usar un filtro azul, que transmite esta luz azul

Teoría del color 15 3. Fundamento de la Espectrofotometría de Absorción UV-visible

(Gp:) amarillo-verde (Gp:) 520 – 550 (Gp:) violeta (Gp:) 380 – 420 (Gp:) amarillo (Gp:) 550 – 580 (Gp:) 420 – 440 (Gp:) anaranjado (Gp:) 580 – 620 (Gp:) azul (Gp:) 440 – 470 (Gp:) rojo (Gp:) 620 – 680 (Gp:) verde-azul (Gp:) 470 – 500 (Gp:) púrpura (Gp:) 680 – 780 (Gp:) verde (Gp:) 500 – 520 (Gp:) verde (Gp:) 500 – 520 (Gp:) púrpura (Gp:) 680 – 780 (Gp:) verde-azul (Gp:) 470 – 500 (Gp:) rojo (Gp:) 620 – 680 (Gp:) azul (Gp:) 440 – 470 (Gp:) anaranjado (Gp:) 580 – 620 (Gp:) azul-violeta (Gp:) 420 – 440 (Gp:) amarillo (Gp:) 550 – 580 (Gp:) violeta (Gp:) 380-420 (Gp:) amarillo-verde (Gp:) 520 – 550 (Gp:) Color absorbido (Gp:) ? (nm) (Gp:) complementario (Gp:) Color observado (Gp:) ? (nm) (Gp:) Una disolución se observa de color azul cuando se ilumina con luz policromática, porque absorbe ? 580-620 nm (anaranjado) y transmite o deja pasar ? 440-470 nm (azul)

azul-violeta 16 3. Fundamento de la Espectrofotometría de Absorción UV-visible

Para cada estado electrónico en una molécula existen varios estados vibracionales y para cada uno de éstos, numerosos niveles rotacionales.

Etotal= Eelectrónica + Evibracional + Erotacional

La radiación absorbida por la molécula puede ser utilizada para originar las diversas transiciones electrónicas posibles.

?E = Ef – Ei = h ? = Energía del fotón absorbido

Diagrama de niveles de energía Teoría de la absorción molecular. Cambios de energía durante la absorción 17 (Gp:) E (Gp:) 3 2 1 0 (Gp:) 3 2 1 0 (Gp:) 3 2 1 0 (Gp:) E0 (Gp:) E1 (Gp:) E2 (Gp:) VIS UV (Gp:) Absorción molecular (Gp:) ?1 ?4 ?´1 ?´4

3. Fundamento de la Espectrofotometría de Absorción UV-visible

Especies absorbentes Las especies absorbentes: moléculas orgánicas y aniones inorgánicos que tienen electrones: en orbitales moleculares s en orbitales moleculares p en orbitales no enlazantes n.

Tipos de transiciones electrónicas : Cuando absorben fotones de E adecuada se pueden dar 4 tipos de transiciones electrónicas: s ? s * n? s * p ? p* n? p* Transiciones electrónicas entre niveles de energía moleculares ? ? n ?* ?* 18 3. Fundamento de la Espectrofotometría de Absorción UV-visible

Especie absorbente Sus electrones más exteriores o electrones de enlace pueden ser elevados a niveles de E más altos al incidir sobre ellas una radiación electromagnética apropiada Grupo cromóforo Grupo atómico presente en una molécula que lleva asociada una banda de absorción electromagnética: C=C; C=O; C=N. Especies con grupos funcionales con enlaces p. Grupos cromóforos ?dobles y triples enlaces. Bandas en el UV cercano y visible. Etileno, carbonilo, éster, amida, nitro… Grupo auxocromo Grupos que no producen por sí mismos bandas de absorción, pero intensifican la de los grupos cromóforos: C-Br; C-OH Responsables del color de muchos iones y compuestos de metales de transición que poseen orbitales d y f Bandas de campo ligando 3. Fundamento de la Espectrofotometría de Absorción UV-visible 19

4. Leyes de la absorción de la radiación Al interaccionar la radiación electromagnética con la materia, tiene lugar la absorción si la ? de la radiación coincide con la energía necesaria para que el sistema pase a un nivel de energía superior y permitido

h ? = E2 – E1

Las dos leyes fundamentales que rigen el comportamiento de la fracción de la radiación incidente absorbida al pasar a través de una muestra dada son:

Ley de Lambert: predice el efecto que produce el espesor del medio-muestra sobre la fracción de radiación que se absorbe.

Ley de Beer: establece el efecto de la concentración del medio-muestra sobre la fracción de radiación que se absorbe.

Ley de Lambert-Beer 20

Ley de Lambert-Beer: muestra cómo la absorbancia es directamente proporcional a la longitud b de la trayectoria a través de la solución y a la concentración c del analito o especie absorbente. a: cte de proporcionalidad llamada absortividad. (unidades L/cm·g, si c=g/L) b: longitud del camino que recorre la radiación a través del medio absorbente. c: concentración expresada en g/L (mg/L, …). Si la concentración c viene expresada en mol/L, la cte de proporcionalidad se denomina absortividad molar y se representa por ? (unidades L/cm·mol). La absortividad molar, ?, es característica de cada especie a una ? determinada Disoluciones que contienen varias especies absorbentes: Para cada ?: Atotal =?Ai = A1 + A2 + …. + An Como A = ? · b · c A = ?1 · b · c1 + ?2 · b · c2 + …. +?n · b · cn Siendo 1, 2, …, n los componentes absorbentes. 4. Leyes de la absorción de la radiación 21

Ley de Lambert- Beer (Gp:) AT,l = (Gp:) log (Gp:) P0 (Gp:) P (Gp:) = (Gp:) e b c (Gp:) Absorbancia total medida a la longitud de onda l (Gp:) Concentración molar de las especies absorbentes (Gp:) camino óptico (Gp:) Potencia del haz después de atravesar la muestra (Gp:) Potencia del haz antes de atravesar la muestra (Gp:) P (Gp:) P0 (Gp:) = Transmitancia (T) (Gp:) A = -logT

Absortividad molar A = e b c Ley de Lambert- Beer 22 4. Leyes de la absorción de la radiación

La Ley de Beer debe comprobarse siempre antes de utilizarla para un análisis cuantitativo exacto. Para ello se preparan una serie de disoluciones estándar del analito en el intervalo en el que se supone que se encuentra la muestra. Se registra el espectro de absorción utilizando una de ellas. Se mide la absorbancia de dada una de las disoluciones a la ? del máximo de absorción del analito con una longitud de cubeta dada, generalmente 1 cm. Se representan las absorbancias en función de las concentraciones. Si la ley de Beer se cumple en todo el intervalo de c estudiado: A = ebc se obtiene una línea recta en todo el intervalo, que pasa por el origen. La recta obtenida se llama Curva de calibrado. Pueden aparecer desviaciones positivas o negativas a partir de una determinada concentración debido a Limitaciones de la ley de Beer y/ó a posibles errores experimentales cometidos

Comprobación de la Ley de Beer. Curva de calibrado 23 4. Leyes de la absorción de la radiación

Desviaciones de la Ley de Beer La proporcionalidad directa entre absorbancia y concentración cuando b es constante, sólo se cumple en un intervalo de concentraciones del analito. Fuera de dicho intervalo se observan en las curvas de calibrado desviaciones positivas o negativas de la linealidad debido a las limitaciones de la Ley de Beer: (Gp:) A (Gp:) concentración (Gp:) Para la aplicación cuantitativa, las medidas de A de la muestra deben estar incluidas en el intervalo lineal (Gp:) respuesta debida a la autoabsorción o a la luz escasa que atraviesa la cubeta (Gp:) respuesta del blanco, interferencias o escasa sensibilidad (Gp:) A= ebc (Gp:) Intervalo lineal

24 4. Leyes de la absorción de la radiación

Limitaciones propias o reales Variación de la absortividad con el índice de refracción n, que varía con la c. Para c < 0,01 M n= cte: Ley de Beer se cumple.

Incumplimiento de las premisas de la ley de Beer. Interacciones entre el soluto y la radiación producidas por mecanismos distintos al de absorción. Interacciones entre las especies absorbentes del soluto . Radiación no monocromática. Limitaciones de la Ley de Beer 25 4. Leyes de la absorción de la radiación

Errores químicos. Efectos debidos a sistemas en equilibrio: equilibrios de dimerización equilibrios ácido-base equilibrios de complejación Efectos debidos al disolvente. Efectos debidos a impurezas absorbentes de los reactivos. Efectos debidos a la presencia de interferencias absorbentes en la muestra. Errores instrumentales. Errores de lectura: El mínimo error relativo se obtiene para una absorbancia de 0,434 Las absorbancias deben estar comprendidas entre 0,2 y 0,8 para obtener el mínimo error Radiación parásita. Errores personales: Utilización y cuidado de las cubetas de absorción. Control de Temperatura. Errores al aplicar la Ley de Beer 26 4. Leyes de la absorción de la radiación

5. Instrumentación Componentes básicos de los espectrofotómetros Fuente de energía radiante Selector de ? Detector Dispositivo de lectura Cubeta muestra 27 (Gp:) Luz compuesta (Gp:) Monocromador (Gp:) I0 (Gp:) I (Gp:) b (Gp:) Luz monocromática (Gp:) Fuente de radiación (Gp:) Detector (Gp:) Muestra

(Gp:) 300 (Gp:) 500 (Gp:) 700 (Gp:) 900 (Gp:) Lámpara de Deuterio (Gp:) Lámpara de Tungsteno o Wolframio (Gp:) longitud de onda (nm) (Gp:) intensidad lumínica (Gp:) 1100

Fuente de energía radiante Continua. Estable. Intensa Para ? en el Visible Para ? en el Ultravioleta Características 28 5. Instrumentación

Selector de ? Filtros de corte Filtros de absorción Filtros de interferencia longitud de onda de máxima transmisión ancho de banda efectivo Características Monocromadores de prisma Monocromadores de red Fotómetros Espectrofotómetros 29 5. Instrumentación

Cubetas Absorción mínima a la longitud de onda de trabajo Colocar con caras transparentes perpendiculares a la dirección del haz incidente Características Vidrio o plástico Visible Sílice Ultravioleta 30 5. Instrumentación

Detectores deben responder a un amplio rango de longitudes de onda deben dar respuesta rápida deben ser sensibles a bajos niveles de radiación deben producir señal eléctrica fácilmente amplificable la señal debe ser proporcional a la potencia radiante Su función es convertir la respuesta del instrumento en una señal medible. Características Fototubos Fotomultiplicadores Fotodiodoarray 31 5. Instrumentación

Espectrofotómetros Haz sencillo Doble haz 32 Fuente de radiación Sistema selector de ? Cubeta de muestra Fotodetector Registrador o PC Fotocelda 1 Fotocelda 2 Cubeta de referencia Amplificador Fuente de radiación Sistema selector de ? Amplificador diferencial Registrador o PC Cubeta de muestra Cubeta de referencia 5. Instrumentación

La espectrofotometría de absorción molecular se puede aplicar tanto al análisis cualititativo como cuantitativo. Análisis cualitativo: los espectros de la muestra se comparan con los de los correspondientes estándares, con el fin de identificar las bandas de absorción coincidentes. Este tipo de análisis es más frecuente en UV e IR para identificar compuestos orgánicos y más rara vez se utiliza en Vis. Análisis cuantitativo: está basado en la ley de Lambert-Beer en el intervalo de concentraciones de cumplimiento de la ley. Se establece la curva de calibrado usando estándares y la absorbancia de la muestra de concentración desconocida se remite a la curva (a veces basta con un solo estándar). En espectrofotometría Vis, el analito se suele incorporar a una especie compleja que presente bandas de absorción intensas. Siempre que sea posible se debe medir la absorbancia a ?max 6. Aplicaciones analíticas 33

Amplia aplicabilidad: Análisis orgánico e inorgánico Elevada sensibilidad: los límites detección de 10-4 a 10-5 M. Selectividad de moderada a alta. Buena exactitud: errores de concentración 1-5% o incluso menores. Facilidad y comodidad en las medidas espectrofotométricas. Se prestan a una fácil automatización. Campo de aplicación Especies absorbentes: compuestos orgánicos que contengan grupos cromóforos y especies inorgánicas como son los metales de transición. Especies no absorbentes: los analitos reaccionan con un reactivo para producir un compuesto absorbente. Características de los métodos espectrofotométricos 34 6. Aplicaciones analíticas

Toma y tratamiento de la muestra

Selección de la longitud de onda

Control de las variables que influyen en la absorbancia

Determinación de la relación entre la absorbancia A y la concentración c Metodología cuantitativa. Detalles del procedimiento experimental Realizar un espectro de absorción de la muestra Para obtener máxima sensibilidad, realizar las medidas de A a una ? que corresponda a un máximo de absorción ?max, ya que el cambio en la absorbancia por unidad de concentración es mayor en este punto. la naturaleza del disolvente el pH de la disolución la temperatura las concentraciones altas del electrolito la presencia de sustancias interferentes Elegir las condiciones para el análisis Calibración con patrones de concentración conocida Método de las adiciones estándar a) El método de un solo punto b) El método de las adiciones múltiples 35 6. Aplicaciones analíticas

Pocas veces es posible suponer el cumplimiento de la ley de Beer y utilizar un único patrón para determinar la absortividad molar.

Comprobar la ley de Beer realizando un calibrado a la ? del máximo de absorción.

Se miden las absorbancias de patrones y muestras y se obtiene la ecuación de la recta de calibrado generalmente aplicando el método de mínimos cuadrados: A = mc + b

Los estándares o patrones de calibración se deben aproximar tanto como sea posible a la composición final de las muestras reales y deben abarcar un intervalo razonable de concentraciones del analito.

La concentración de la muestra se calcula a partir de la ecuación de la recta de calibrado sustituyendo su valor de A y despejando la c correspondiente Calibración con patrones de concentración conocida Metodología cuantitativa. Detalles del procedimiento experimental 36 6. Aplicaciones analíticas

Calibración con patrones de concentración conocida Analito en la muestra A muestra A (? = 508 nm) 37 6. Aplicaciones analíticas

Cuando se analizan muestras complejas, como alimentos ó cenizas vegetales, suele ser imposible o muy difícil preparar estándares que se asemejen a las muestras. En este caso, el método de las adiciones estándar es útil para contrarrestar los efectos de matriz. Método de las adiciones estándar Método de las adiciones estándar. El método de un solo punto Se toman dos porciones de la muestra Una porción se mide como de costumbre A la segunda porción se le agrega una cantidad conocida de la disolución estándar de analito Ambas respuestas se utilizan entonces para calcular la concentración desconocida, suponiendo una relación lineal entre la respuesta y la concentración del analito Metodología cuantitativa. Detalles del procedimiento experimental 38 6. Aplicaciones analíticas

Absorbancia de la primera disolución A1 = K cx

cx concentración desconocida de analito en la 1ª disolución K constante de proporcionalidad.

Absorbancia de la segunda disolución A2 = (K vx cx / v t) +( K v s c s / v t)

vx volumen de la disolución de concentración desconocida de analito, vs volumen agregado de la disolución estándar de analito, v t es el volumen total después de la adición y cs es la concentración de la disolución estándar de analito

cx = A1 v s c s / A 2 v t – A1 vx

Método de las adiciones estándar. El método de un solo punto 39 6. Aplicaciones analíticas

Método de las adiciones estándar. El método de las adiciones múltiples Varias alícuotas idénticas Vx de la solución desconocida con concentración Cx se transfieren a matraces volumétricos de volumen Vt. A cada uno de esos matraces se le añade un volumen variable Vs de una disolución patrón del analito, con concentración conocida Cs. Después, se añaden los reactivos que originan el color y se diluye cada solución hasta un volumen Vt. Si el sistema químico sigue la ley de Beer,

A i= (e b Vs Cs / Vt ) + (e b Vx Cx / Vt ) = K Vs Cs + K Vx Cx K es una constante = e b / Vt

Una gráfica de AI en función de Vs debe originar una recta de la forma A i = m Vs + b Donde la pendiente m y la ordenada en el origen b vienen dadas por m = K Cs y n = K Vx Cx El análisis de mínimos cuadrados de los datos se puede utilizar para determinar m y b; después, es posible calcular Cx a partir del cociente de esas dos cantidades y los valores conocidos de Vx y Cs Cx = (Cs / Vx ) ( n/m) 40 6. Aplicaciones analíticas

A = mc+b 0 = mc muestra + b Cmuestra = b/m Método de las adiciones estándar . El método de las adiciones múltiples Concentración añadida del estándar Concentración de la muestra A0 A1 A2 A3 c1 c2 c3 41 6. Aplicaciones analíticas

La espectroscopia en la región ultravioleta-visible (UV-Vis) es una de las técnicas de laboratorio más comúnmente encontradas en el análisis de los alimentos. Ejemplos: Cuantificación de macrocomponentes (el contenido total de hidratos de carbono, por medio del método del fenol-ácido sulfúrico) Las estimaciones de enranciamiento (el estado de la oxidación de los lípidos, por medio del ensayo del ácido tiobarbitúrico) Determinación de pigmentos basada en su absorción de radiación en la zona del visible

Análisis del contenido de proteínas solubles. Determinación de nitritos en jamón de York Determinación de hierro en vinos Determinación de fosfato en bebidas Aplicaciones al análisis de alimentos 42 Especies que no absorben en el Visible: mediante su reacción previa con reactivos adecuados para dar un compuesto coloreado 6. Aplicaciones analíticas