Bioensayos de toxicidad

Índice 2. Materiales y métodos3. Resultados y discusión4. Conclusiones5. Recomendaciones6. Bibliografía

1. Introducción

Los bioensayos de toxicidad permiten evaluar el grado de afectación que una sustancia química tiene en organismos vivos y éstos pueden ser agudos o crónicos. Las pruebas agudas cuantifican las concentraciones letales de un xenobiótico a una especie en particular. El valor calculado se denomina concentración letal media (CL50) y corresponde a la concentración de un xenobiótico que causa la muerte al 50 % de la población experimental al cabo de un tiempo determinado, generalmente en 48 o 96 horas. En contraste, las pruebas crónicas estiman la concentración – efecto media (CE50) de la sustancia de prueba que causa un efecto al 50 % de la población experimental, al cabo de un tiempo determinado (Rodríguez y Esclapés, 1995). Para regular las descargas de aguas residuales tóxicas hay que utilizar datos de ensayos de toxicidad hechos con organismos vivos y confiar en estos datos, además de efectuar estudios detallados de las características físicas y químicas de los contaminantes y de los cambios que ocurren después de su descarga en el medio. Cuando se puedan describir con precisión en términos químicos y físicos los componentes tóxicos de un contaminante y se disponga de técnicas analíticas pertinentes y de suficiente información acerca de la toxicidad de esos componentes para los organismos acuáticos, se podrán establecer normas para tales contaminantes en valores numéricos para los componentes tóxicos (FAO, 1981). Los bioensayos de toxicidad con agentes contaminantes en organismos vivos bajo condiciones de laboratorio, se han incrementado en estos últimos tiempos debido a la brevedad con que se obtiene la información sobre las dosis letales y subletales (CL50) que afectan negativamente organismos vivos en los ambientes marinos, estuarinos y dulceacuícolas (Villamar, 1996). El uso de bioensayos para la evaluación de toxicidad de sustancias liberadas al medio a través de efluentes, ha llevado a la utilización de biomonitores propios de los ambientes evaluados, lo cual favorece indirectamente la preservación de la biodiversidad local. Sin embargo, la variabilidad en la aplicación de las técnicas experimentales para el mantenimiento de organismos silvestres afecta la interpretación y comparación de los resultados entre laboratorios, por lo que se hace necesario desarrollar metodologías estandarizadas para establecer condiciones controladas (Palacios y Pereira, 1997). Utilizar organismos provenientes directamente del hábitat natural puede distorsionar los resultados obtenidos por fuentes de variabilidad no previstas, como nutrición, dinámica de la población, estrés por depredación, etc. (Sosnowski et al., 1979). Estas variables pueden ser controladas o eliminadas con las poblaciones de laboratorio; además, el entrecruzamiento consanguíneo que ocurre a lo largo del tiempo en esas poblaciones, resulta en una considerable reducción de la variabilidad genética (Lewontin, 1974). Por otra parte, a causa de la complejidad del medio ambiente acuático y de las comunidades biológicas que lo integran es difícil establecer el grado de deterioro que afecta a las especies o comunidades acuáticas. Por esta razón es conveniente realizar bioensayos utilizando organismos vivos en condiciones controladas de laboratorio. Sin embargo, el objetivo primordial de un bioensayo es reflejar la realidad de cómo afectaría a los organismos vivos en su medio natural y para ello es recomendable paralelamente investigar continuamente las comunidades en su propio hábitat (Villamar, 1996). La captación y utilización de zooplancton como biomonitor data desde comienzos del siglo XX, hoy en día, gracias al desarrollo de técnicas para su cultivo en el laboratorio, representa una herramienta que gana cada vez más reconocimiento en la evaluación ecotoxicológica (Sosnowski et al., 1979; Maciorowski, 1981). Según Reish y Oshida (1987), para la realización de bioensayos es conveniente el uso de zooplancton por su pequeña talla; requerimiento de poco espacio de laboratorio y poco volumen de agua; gran sensibilidad a sustancias tóxicas; ciclo de vida corto; requerimientos nutricionales generalmente conocidos, lo cual lo hace ideal para estudios de bioacumulación. Dentro de los organismos comúnmente utilizados en los bioensayos de toxicidad se encuentran los cladóceros, también llamados pulgas de agua, son crustáceos pequeños que constituyen la mitad de la Clase Branchiopoda (Figura 1). El caparazón (bivalvo) encierra al tronco, pero no a la cabeza y suele terminar posteriormente en una espina apical. La cabeza porta un sólo ojo nauplio mediano, también posee antenas frecuentemente largas y utilizadas en la natación. Además, presenta de cuatro a seis pares de apéndices troncales y el potsabdomen esta girado ventralmente hacia delante. La mayoría de estos organismos son pálidos y transparentes y viven casi exclusivamente en agua dulce (Ruppert y Barnes, 1996).

Figura 1.- Vista general de cladóceros, Daphnia pulex. Fuente: Microsoft Encarta 2001. En condiciones favorables se reproducen partenogenéticamente (asexualmente) (Figura 2) cada tres o cuatro días, siendo la población constituida solamente por hembras. Si el medio se torna desfavorable se reproducen sexualmente, apareciendo en la población hembras que producen huevos de resistencia llamados efipios y machos, los cuales fecundaran estos huevos. Si las condiciones ambientales vuelven a ser favorables estos efipios darán hembras partenogenéticas (Tortorelli y Hernández, 1995).

Figura 2.- Reproducción partenogenética, hembra Daphnia sp. con huevos partenogenéticos

Fuente: UDEC. 2001. http://www.udec.cl/bioensayos/recursos_biologicos.html

Debido a su amplia distribución, su importancia ecológica y su sensibilidad a ambientes intervenidos, se les considera especies indicadoras de condiciones ambientales adversas. Además, por ser organismos de fácil mantenimiento bajo condiciones de laboratorio, normalmente se utilizan en pruebas de toxicidad acuáticas. En Venezuela existen numerosas especies de cladóceros que habitan los lagos naturales y artificiales, zonas inundables y charcas temporales (Rodríguez y Esclapés, 1995). En este sentido, Moina macrocopa (Figura 3) es una especie cosmopolita, un crustáceo encontrado tanto en agua dulce como salobre, habita en lugares donde las temperaturas oscilan entre 5 y 30 °C y con un pH del agua desde neutral hasta ligeramente alcalino (Rodríguez y Esclapés, 1995; Martínez y Gutiérrez, 1997). Esta especie, como muchas otras de cladóceros, tolera lugares donde existen abruptas disminuciones en la concentración de oxígeno disuelto y alcanzan altas densidades en cuerpos de agua con gran cantidad de materia orgánica (Martínez y Gutiérrez, 1997). Esta especie es de talla relativamente grande comparada con otras especies presentes en nuestro país, es fácil de cultivar en el laboratorio, posee alta fecundidad y su ciclo de vida es de 60 días a 20 °C. Se encuentra en ambientes acuáticos con una dureza total que excede a los 150 mg/l de CaCO3 (Esclapés, 1999). En Venezuela ha sido reportada en Valencia, Edo. Carabobo, en el Edo. Aragua y en la Isla de Margarita, Edo. Nueva Esparta (Pereira y García, 1995; Rodríguez y Esclapés, 1995; Hernández et al, 1999).

Figura 3.- Vista general de Moina macrocopa. Fuente: Lebendfutter-Zuchtansatz. 2001. Existen numerosos trabajos realizados con cladóceros sometiéndolos a metales pesados: Pereira y García (1994), Rodríguez y Esclapés (1995), Martínez-Tabche et al.(1997), Baillieul y Blust (1999), Esclapés (1999). También se han hecho experiencias utilizando insecticidas como contaminantes: Bergling y Dave (1984), Gliwicz y Sieniawska (1986), Chu et al. (1997), Dewey y Parker (1998), demostrando que estos organismos son ampliamente utilizados como bioindicadores. La empresa Bauxilum, de la Corporación Venezolana de Guayana (C.V.G.), se encarga de las extracciones de bauxita y de la producción de alúmina, utilizadas comercialmente para la elaboración de aluminio metálico. El proceso Bayer (Bayer, 1887), como paso intermedio en la obtención del aluminio, es la etapa industrial que extrae el óxido de aluminio contenido en la bauxita. Este proceso genera un residuo o desecho que se conoce como "lodo rojo", que es una suspensión sólido/líquido, constituida principalmente por 20 – 30 % de sólidos y una solución acuosa cáustica. Los sólidos están constituidos por una fracción gruesa formada principalmente por arena silícica, y una fracción muy fina con un alto contenido óxidos de hierro. Además, el lodo rojo contiene: óxido de aluminio residual, sílice, óxido de titanio y soda cáustica (NaOH), ésta última disuelta en la fracción líquida, lo cual le da un carácter alcalino con pH superior a 12 (Manrique y Crespo, 1998). Los hidróxidos son irritantes oculares y graves irritantes cutáneos; muy corrosivos para ojos, piel y membranas mucosas (Greenpeace, 2001). Particularmente el hidróxido de sodio es una sustancia tóxica entre 50 y 500 mg/kg según la clasificación de Nancy – Metz (2002). La DL50 por vía oral para conejo es de 500 mg/kg. Por otra parte, tiene efectos tóxicos en peces y plancton como consecuencia del cambio de pH que produce; llegando incluso a ocasionar la muerte de peces (Merck®, 1999). En caso de inhalación produce quemaduras de las mucosas. El contacto con la piel y con los ojos ocasiona quemaduras y hasta perdida de la vista; por ingestión causa irritación de las mucosas de la boca, la garganta, el esófago y el tubo digestivo, con peligro de perforación del esófago y el estómago (Nancy – Metz, 2002). El hidróxido de sodio es irritante y corrosivo de los tejidos. En biopsias de piel realizadas a personas voluntarias exponiéndolas a disoluciones de NaOH 1 N en los brazos de 15 a 180 minutos se observaron cambios progresivos, empezando con disolución de células en las partes callosas, pasando por edema y llegando incluso a destrucción total de la epidermis en 60 minutos (UNAM, 1998). Se han reportados casos de disolución total de cabello, calvicie irreversible y quemaduras del cuero cabelludo en trabajadores expuestos a disoluciones concentradas de hidróxido de sodio por varias horas. Las disoluciones de concentración menor del 0,12 % dañan la piel humana en aproximadamente 1 hora. Por otro lado, una disolución acuosa al 5 % genera necrosis cuando se aplica en la piel de conejos por 4 horas (UNAM, 1998). La CL50-96h de NaOH en peces es 189 mg/l y en organismos acuáticos la CL50 se encuentra entre 10 – 100 mg/l en 96 h (Merck®, 1999). C.V.G. Bauxilum deposita su desecho de producción, lodo rojo, en tres lagunas adyacentes al río Orinoco (Figura 4), Ciudad Guayana, Edo. Bolívar. Este sistema lagunar fue construido en 1979 con un diseño para 21 años de vida útil. Debido a que la capacidad del sistema original ya fue agotada, se han hecho modificaciones para prolongar su vida, como elevaciones de los diques (Figura 5) y construcción de diques filtrantes (CAVSA, 2001a).

Figura 4.- Vista general de lagunas de lodo rojo.

Figura 5.- Elevaciones de los diques de las lagunas de lodo rojo. Dichas lagunas actualmente presentan problemas de filtración, debido a falta de obras de ingeniería que las acondicione a recibir el producto del proceso (pantallas impermeables) y al gran volumen en ellas depositadas (lodo rojo, agua de lluvia); permitiendo el paso de este material a otras lagunas naturales o al río Orinoco. Además en períodos de lluvia por el aumento de volumen en las lagunas existe la posibilidad que ocurran desbordamientos, aunque nunca ha sucedido. El almacenamiento de los lodos rojos constituye un problema de gran magnitud para la industria del aluminio a nivel mundial (Stinson, 1979). Las bajas velocidades de sedimentación de los lodos rojos hacen que los embalses requieran cada vez mayores extensiones de terreno. Por otro lado la soda cáustica (NaOH) constituye un factor de contaminación ambiental. El rebose inesperado de un embalse de almacenamiento, debido a condiciones climatológicas, podría generar la contaminación y muerte de los ríos y afluentes aledaños a la planta (Manrique y Crespo, 1998). Además, las características tixotrópicas de los lodos rojos inducen problemas de consolidación, invalidando las áreas o lechos de embalses para efectos de construcción o reforestación (Nguyen y Boger, 1983). El 24 de junio del año 2001 fueron reportadas en la prensa local "Correo del Caroní" (Pág. A -1) muertes extrañas de peces en la laguna natural de Cambalache, estado Bolívar, Venezuela. Graffe (2001) estudia la existencia de filtraciones en el Dique Nº 12 de las lagunas de lodo rojo, el cual se intercepta con el canal Nº 5 para aguas de escorrentía que culmina en la laguna natural de Cambalache. Estas filtraciones representan una posible causa de la mortandad de peces ocurrida en dicha laguna. Las filtraciones están siendo remediadas temporalmente mediante el uso de bombas que devuelven el desecho a las lagunas de deposición (Figura 6).

Figura 6.- Bombeo de licor cáustico proveniente de filtraciones existentes en las lagunas de depósito.

La Dirección Estadal del Ministerio del Ambiente y de los Recursos Naturales del estado Bolívar, Venezuela, expone el 9 de julio del 2001, en un reporte a la prensa local "Correo del Caroní" (Pág. D – 1), la necesidad de realizar experiencias con organismos vivos para determinar si realmente el lodo rojo fue la causa de muerte de los peces. Es importante señalar que en dicha zona descargan los desechos de una granja de porcinos, de una fábrica de bloques y además existe el relleno sanitario municipal Cambalache (Graffe, 2001). Esta situación es alarmante ya que en dicha zona se encuentran viviendo aproximadamente 9.500 personas que tienen libre acceso a las lagunas naturales y de lodo rojo, llegando incluso algunos a pescar y consumir el agua de las lagunas naturales, como por ejemplo, la laguna de Cambalache. No se encuentra estipulado en algún decreto o norma de las leyes venezolanas las concentraciones máximas permisibles de hidróxido de sodio en los vertidos líquidos.

Objetivo General Determinar, mediante el uso de bioensayos agudos, el efecto del hidróxido de sodio (NaOH) principal componente del desecho (lodo rojo) de la empresa C.V.G. Bauxilum, sobre el cladócero Moina macrocopa. Los objetivos específicos son:

• Determinar la concentración letal media (CL50) para ejemplares de Moina macrocopa, sometidos a soluciones de hidróxido de sodio (NaOH) utilizando agua sintética dura.
• Determinar la concentración letal media (CL50) para ejemplares de Moina macrocopa, sometidos a soluciones de hidróxido de sodio (NaOH) utilizando agua del río Orinoco
• Comparar la sensibilidad presentada por los ejemplares de Moina macrocopa, expuestos a soluciones de hidróxido de sodio (NaOH), en agua sintética dura y en agua del río Orinoco.

2. Materiales y métodos

Organismo Experimental Los bioensayos se realizaron con la especie Moina macrocopa (Straus, 1820), la cual fue colectada del canal de aguas servidas de la Ciudad de Juan Griego, Isla de Margarita, Venezuela e identificada por el Laboratorio de Cultivo de Zooplancton del Instituto de Investigaciones Científicas (I.I.C.) de la Universidad de Oriente, Núcleo Nueva Esparta, Venezuela. La selección de Moina macrocopa obedeció a la disponibilidad de cepas por parte del I.I.C.; la existencia de protocolos estandarizados para bioensayos de toxicidad específicos descritos por Rodríguez y Esclapés (1995) y Esclapés (1999); su condición cosmopolita, reportándose en Venezuela en los estados Carabobo, Aragua y Nueva Esparta (Pereira y García, 1995; Rodríguez y Esclapés, 1995; Hernández et al, 1999); su importancia ecológica y su sensibilidad a ambientes intervenidos; además de ser organismos de fácil mantenimiento bajo condiciones de laboratorio.

Preparación del Material de Vidrio Toda la vidriería utilizada se limpió de acuerdo a la metodología descrita por Esclapés (1999). Preparación del Medio de Cultivo: Se siguieron los protocolos estándares de Esclápes (1999). Solución madre de KCl: Se colocaron 8 g de KCl (grado reactivo) en un balón volumétrico de 1 l, se aforó a 1 l con agua destilada y se almacenó en botellas de polietileno de 1 l. Solución madre de MgSO4: Se colocaron 120 g de MgSO4 anhidro (grado reactivo) en un balón volumétrico de 1 l, y se aforó a 1 l con agua destilada. La solución así preparada se almacenó en botellas de polietileno de 1 l hasta su uso. Solución madre de NaHCO3: Se colocaron 96 g de NaHCO3 (grado reactivo) en un balón volumétrico de 1 l, se aforó a 1 l con agua destilada y se almacenó en botellas de polietileno de 1 l. Agua sintética dura: Se añadieron 18,2 l de agua destilada en un envase plástico limpio de 20 l, y se adicionaron 2,4 g de CaSO4.2H2O a 1 l de agua destilada, contenida en un vaso precipitado de 2 l mezclando hasta disolver por completo el soluto. Esta solución se transfirió al envase de 20 l donde se mezcló con el agua contenida en el recipiente mencionado. Adicionalmente se agregaron al envase de 20 l las soluciones madres en los siguientes volúmenes:

• 20 ml de KCl
• 20 ml de MgSO4
• 40 ml de NaHCO3

Se suministro aireación durante más de 2 horas. En el laboratorio de Ambiente de C.V.G. Bauxilum se determinó la dureza cálcica, dureza magnésica y dureza total del agua sintética dura.

Agua del río Orinoco: El 31 de octubre de 2001 a las 8 a.m. se tomó una muestra de 160 l de agua del río Orinoco en el muelle de C.V.G. Bauxilum, estado Bolívar, Venezuela. El agua se filtró con un tamiz de 60 m m, fue caracterizada por el laboratorio de Ambiente de C.V.G. Bauxilum y se almacenó en cuatro envases plásticos de 40 l. Antes de su utilización se sometió durante 15 h a rayos ultravioleta para su desinfección y se suministro aireación por 2 h.

Cultivo de Moina macrocopa: Dependiendo del tipo de bioensayo a ser utilizados, los organismos de Moina macrocopa se colocaron en vasos precipitados de 2 l, con 1 l de agua sintética dura o de agua del río Orinoco. Después de realizar un recambio de agua diario del 75 %, los organismos se alimentaron con alimento formulado para zooplancton Z-plus® de la marca comercial Zeigler®, a una ración de 180 mg/l. Debido que el alimento es de tamaño de partícula de 100 – 150 µm, se permitió su disolución en medio de cultivo durante 30 min y finalmente, se pasó por un tamiz de 60 µm. Semanalmente se cambiaron de recipiente para la limpieza del envase y tres veces por semana mediante limpieza de fondo se extrajeron las mudas y otros sedimentos con una micropipeta digital de 200 – 1000 m l marca Labsystems®. Durante el cultivo se mantuvo una temperatura de 20 ± 1 ºC; fotoperíodo de 9 h luz, 15 h oscuridad y no se suministró aireación. Cuando se observo disminución en la fecundidad o presencia de machos se dividieron las cepas en réplicas para reducir la densidad de los organismos. Los cladóceros se aclimataron durante 15 días a las nuevas condiciones de laboratorio antes de ser utilizados en los bioensayos.

Obtención de Neonatos El día anterior a las pruebas, fueron separadas 40 hembras presentando embriones en avanzado estado de desarrollo. Cada hembra se colocó en un tubo de ensayo de 25 ml de capacidad con 15 ml de medio de cultivo, manteniendo las mismas condiciones de cultivo, excepto por el fotoperíodo que no se le aplicó. A las 24 h se confirmaba la presencia de neonatos y estos se separaban con una micropipeta digital de 200 – 1000 m l marca Labsystems® transfiriéndose a botellas de cultivo de vidrio Kimax® de 250 ml de capacidad con 100 ml de solución de exposición, comenzando por el control y terminando con las concentraciones más altas. Se tomó especial cuidado en el proceso transferencia para no añadir demasiado medio de cultivo con el objeto de no alterar las concentraciones.

Solución Madre de Hidróxido de Sodio (NaOH) Se preparó una solución madre de hidróxido de sodio (NaOH) de 1000 mg/l a partir de hidróxido de sodio (NaOH) (P.M. 40,00 gr/mol) en lentejas marca Riedel-de Haën® con calidad A.C.S (American Chemical Society). Se tomaron 1000 mg de hidróxido de sodio, se disolvieron en agua destilada y desionizada y se aforó a 1 l. Se almacenó en envase de vidrio.

Preparación de diluciones de hidróxido de sodio (NaOH) Las soluciones de hidróxido de sodio se elaboraron empleando vidriería volumétrica, a partir de la solución madre de hidróxido de sodio de 1000 mg/l diluyéndose con agua sintética dura o agua del río Orinoco dependiendo del bioensayo a ser realizado, en un volumen de 1000 ml. Se determinó sodio total en todas las diluciones utilizadas en los ensayos por espectrofotómetro de absorción atómica Perkin Elmer® 1100B.

Bioensayos Agudos Preliminares: Estas pruebas se realizaron con la finalidad de establecer el intervalo de concentraciones de las soluciones de exposición de hidróxido de sodio (NaOH) que serían utilizadas en las pruebas finales (Tabla 1).

Tabla 1 Condiciones presentes durante los bioensayos de toxicidad aguda con Moina macrocopa

Los bioensayos se realizaron en botellas de cultivo de vidrio Kimax® de 250 ml.

Se utilizaron las diluciones de prueba (35, 50, 65, 75 y 100) mg/l de hidróxido de sodio con agua sintética dura y (23, 25, 28, 30 y 33) mg/l de hidróxido de sodio con agua del río Orinoco. Cada ensayo dispuso de un control sin hidróxido de sodio.

Bioensayo Agudo Final: Luego de determinadas las diluciones de hidróxido de sodio (NaOH) a utilizar mediante los bioensayos preliminares, se procedió con los ensayos finales. La diferencia en la sensibilidad presentada por Moina macrocopa en los dos medios expuestos a NaOH determinó el uso de concentraciones distintas.

Bioensayo agudo final con agua sintética dura: Se sometieron los organismos a cinco diluciones (23, 25, 28, 30 y 33) mg/l de hidróxido de sodio y un control sin hidróxido de sodio, todos con sus respectivas réplicas. Se hicieron observaciones del número de organismos vivos y muertos, considerándose muertos aquellos individuos sin movimiento del corazón mediante la observación con microscopio estereoscópico Nikon®; a los 15 min, 30 min, (1, 2, 4, 8, 24, 36, 48) h. Se determinó el pH y el oxígeno disuelto (OD) a (0, 24 y 48) h en botellas de Winkler de 300 ml, el pH con equipo Orion® 720A y el oxígeno disuelto con un YSI® 58.

Bioensayo agudo final con agua del río Orinoco: Se siguió el mismo diseño experimental descrito en el bioensayo anterior pero con las concentraciones (15, 18, 20, 23 y 25) mg/l de hidróxido de sodio y se utilizó agua del río Orinoco como medio de dilución. Las concentraciones de NaOH utilizadas en los bioensayos finales se establecieron dentro del rango donde se presenta la concentración letal media para Moina macrocopa, permitiendo un eficiente cálculo mediante los programas computarizados utilizados.

Análisis de Datos: Los datos obtenidos fueron analizados mediante los programas Binomial, Logit, Moving Average y Probit, utilizando el programa computarizado de Stephan 1977 (Esclapés, 1999).

3. Resultados y discusión

Agua Sintética Dura El cultivo de cladóceros puede realizarse con éxito en muchos tipos de aguas naturales, pero es preferible el uso de medios sintéticos reconstituidos. Estos medios son fáciles de preparar, producen resultados predecibles y permiten una adecuada tasa de crecimiento y reproducción (Clesceri et al, 1998). La especie Moina macrocopa generalmente habita en ambientes acuáticos que presentan una dureza total superior a 150 mg/l CaCO3 (Esclapes, 1999). En la Tabla 2 se observan los valores de dureza presentes en el medio de cultivo. Tabla 2 Determinación de valores promedios de durezas presentes en el medio de cultivo agua sintética dura

La dureza total obtenida (162,3 mg/l) es acorde al rango preparado (160 – 180 mg/l CaCO3) y resulta ideal para el cultivo de la especie. El pH del medio varió durante el cultivo y los ensayos en un rango de 8,1 – 9,0; con un promedio de 8,5. Lewis y Weber (1985) señalan un rango óptimo de pH entre 7,0 – 8,6 para Daphnia.

Agua del Río Orinoco Tabla 3 Caracterización de los factores físico-químicos presentes en el agua del río Orinoco utilizada en los bioensayos

• Según Gaceta Oficial Nº 5021. Decreto Nº 883. Aguas Tipo 4A.

El pH (6,439) y los fenoles (0,606 mg/l) se encuentran fuera de los valores permitidos en el Decreto Nº 883 (Gaceta Oficial Nº 5021, 1995) si clasificamos el uso de la muestra de agua del río Orinoco como agua de Tipo 4A (Aguas destinadas a balnearios, deportes acuáticos, pesca deportiva, comercial y de subsistencia. Aguas para el contacto humano total). C.V.G. (1999) encontró valores máximos de fenoles de 0,15 mg/l los cuales pueden ser provenientes de los efluentes por los lavados de aceites de motores en las industrias y principalmente de los depósitos de brea de la industria del aluminio. La aparición de estos altos valores de fenoles (0,606 mg/l) en la muestra del agua del río puede provenir principalmente de procesos industriales metalúrgicos de Alcasa, Venalum y Sidor, y de descargas del colector pluvial municipal. La presencia de fenoles en las aguas puede causar sabores y olores desagradables al producirse clorofenoles por la aplicación de procesos de cloración; además son compuestos tóxicos que pueden causar daños a la salud del ambiente (COVENIN, 1992). Al sumar varias aguas residuales distintas, se supone que los efectos tóxicos de todas ellas son estrictamente aditivos (FAO, 1981). Estos compuestos pueden haber provocado un efecto sinérgico del hidróxido de sodio sobre Moina macrocopa. El pH del río Orinoco (6,439) aunque se encuentra por debajo del límite mínimo (6,5) estipulado en el decreto Nº 883 (Gaceta Oficial Nº 5021, 1995) para aguas Tipo 4A, es una condición normal para este río. C.V.G. (1999) encontró un pH entre 6,2 y 9,8 con una media de 6,9; Lewis y Sauders (1990) un promedio de 6,8; y Vásquez y Sánchez (1984) reportaron una variación entre 5,9 y 8,3 con un promedio de 7.

Cultivo de Moina macrocopa Los organismos se adaptaron positivamente a las nuevas condiciones de laboratorio y a los dos medios de cultivos utilizados, se observó un aumento considerable de la densidad antes de los siete días de cultivo. Fue necesaria la disminución de la densidad semanalmente para garantizar gran cantidad de hembras en estado de gravidez. Se encontró en una oportunidad la presencia de machos y de efipios en la cepa con agua sintética dura, los cuales se eliminaron al disminuir la densidad. Ruppert y Barnes (1996) indican que determinados factores, como pueden ser cambios en la temperatura del agua o un descenso de la disponibilidad de alimento debida a un aumento de la población, inducen a la aparición de machos, y se producen huevos fecundados. Posteriormente se dispuso de mayor control a la densidad para que no representara una condición limitante en el crecimiento de la población. Los factores más importantes que controlan el crecimiento poblacional y reproducción de los cladóceros son la temperatura, intensidad de luz, cantidad y calidad de alimento (Ojala et al, 1995). Tortorelli y Hernández (1995) recomiendan como condiciones favorables para Daphnia, como material biológico de bioensayo, temperatura de 20 ± 1 ºC y fotoperíodo 12 h luz – 12 h oscuridad. López y Cabrera (1988) señalan que la mejor condición de crecimiento de población de algunos cladóceros es aplicar un fotoperíodo de 12 h luz – 12 h oscuridad. En el presente trabajo no existió esta misma condición pero se empleo un fotoperíodo de 9 h luz – 15 h oscuridad, período recomendado por Esclapés (1999), manteniendo la temperatura a 20 ± 1 ºC. Baillieul y Blust (1999) en su experiencia con Daphnia magna expuesta a cadmio utilizaron una temperatura de 20 ± 1 ºC, fotoperíodo 14 h luz – 10 h oscuridad y un pH ≈ 8; mientras el Centro Internacional de Investigaciones para el Desarrollo (1998) sugiere una temperatura de 21 ± 2 ºC y un fotoperíodo de 16 h luz / 8 h oscuridad, demostrando que los parámetros físico-químicos varían un poco de autor a autor pero todos se ubican dentro del rango utilizado en el presente bioensayo. Los individuos consumían el alimento, lo cual se comprobó al presentar el tracto digestivo lleno. La ración del alimento Z-plus® suministrada (180 mg/l) diariamente fue la recomendada por Jiménez (2000). Esta resultó eficiente para los organismos y debido al recambio diario de agua no se presentaron problemas si esta no era consumida totalmente. En el trabajo de Jiménez (2000) el alimento para zooplancton Z-plus® fue el que presentó mayor crecimiento poblacional en salinidad de 0 ‰ para Moina macrocopa al ser comparado con dietas de levadura y de la microalga Scenedesmus abundans. Las respuestas positivas de Moina macrocopa a los medios de cultivo indica que las condiciones establecidas resultaron óptimas.

Preparación de Diluciones de Hidróxido de Sodio (NaOH) Las concentraciones de sodio total determinadas, en todas las diluciones utilizadas en los bioensayos, por espectrofotometría de absorción atómica resultaron muy similares a las esperadas, indicando que las diluciones se prepararon correctamente (Tabla 4). Tabla 4 Concentraciones de sodio total presentes en las soluciones utilizadas en los bioensayos

Se presentó sedimento de color blanco en las soluciones más altas de hidróxido de sodio (pH > 10,6) con agua sintética dura. En aguas sumamente alcalinas (pH 11) una fracción del calcio disuelto se puede precipitar (Margalef, 1983). El sedimento encontrado pueden ser carbonatos de calcio precipitados al existir un aumento de pH en las diluciones, pero este no interfirió en las botellas utilizadas en los bioensayos ya que se tomo la parte superior de la solución y el sedimento fue despreciado.

Bioensayos Agudos Preliminares Bioensayo agudo preliminar con agua sintética dura No existió muerte en ninguna solución durante las primeras 4 h de exposición. Todas las concentraciones probadas (35, 50, 65, 75 y 100) mg/l de NaOH reportaron un 100 % de mortalidad a las 48 h, y las cuatro mayores a las 36 h. El control presentó tres individuos muertos (15 %) (Tabla 5, Figuras 7 y 8).

Tabla 5 Mortalidad de Moina macrocopa presentada en Bioensayo agudo preliminar con agua sintética dura

Fig 7.- Mortalidad de Moina macrocopa presentada en Bioensayo agudo preliminar con agua sintética dura.

Fig 8.- Porcentaje de mortalidad de Moina macrocopa presentada en Bioensayo agudo preliminar con agua sintética dura a las 48 horas. Las concentraciones de hidróxido de sodio (35, 50, 65, 75 y 100) mg/l utilizadas en este bioensayo resultaron sumamente tóxicas para los individuos de Moina macrocopa, provocando la muerte de todos los organismos expuestos. Nancy-Metz (2002) reportan un CL50 en 24 h de hidróxido de sodio en Daphnia de 150 mg/l, lo cual es un valor alto al compararlo con los resultados obtenidos en el bioensayo preliminar de agua sintética dura donde se encontró un 80 % de mortalidad de Moina macrocopa al exponerlo a 50 mg/l de NaOH a las 24 h. Las Tablas 6 y 7 muestran los valores obtenidos de oxígeno disuelto y pH respectivamente. El oxígeno disuelto varió entre 8,52 y 9,02 mg/l en todas las soluciones. El pH fue diferente en todas las concentraciones observándose los menores valores en el control (8,146) y en 35 mg/l de NaOH (9,807), y el mayor valor para 100 mg/l de NaOH (11,219); con una desviación con respecto al control de 1,658 – 2,917. Esto sugiere que el hidróxido de sodio fue el responsable del aumentó de pH.

Tabla 6 Valores de Oxígeno Disuelto (OD) determinados en el Bioensayo agudo preliminar con agua sintética dura

Bioensayo agudo preliminar con agua del río Orinoco Debido a que existió un 100 % de mortalidad en las concentraciones (35, 50, 65, 75 y 100) mg/l de NaOH utilizadas en el bioensayo preliminar con agua sintética dura, se experimentó con menores concentraciones (23, 25, 28, 30 y 33) mg/l de NaOH en el ensayo de biobusqueda con agua del río Orinoco. No se presentaron muertes en ninguna concentración durante las primeras 2 h de exposición. Todas las concentraciones utilizadas (23, 25, 28, 30 y 33) mg/l de NaOH presentaron por lo menos un 70 % de mortalidad a las 48 h, las tres concentraciones más altas tuvieron un 100 %. El control no presentó mortalidad (Tabla 8, Figuras 9 y 10).

A las 36 h de exposición las concentraciones mayores de NaOH (30 y 33) mg/l provocaron la muerte a todos los cladóceros; a las 48 h no se encontró ningún individuo vivo en 28 mg/l y sólo uno en 25 mg/l. En la menor concentración (23 mg/l) murieron 14 organismos (70 %) a las 48 h. Lo que indica que la CL50 se encuentra por debajo de esta concentración. El oxígeno disuelto osciló entre 8,57 y 9,03 mg/l en todas las soluciones de exposición (Tabla 9). El pH presentó una media de 6,490 en el control, mientras en las demás diluciones se ubicó por encima de 10,4; con una desviación con respecto al control superior a 3,95 (Tabla 10).

La concentración de oxígeno disuelto se ubicó en un rango óptimo en todas las concentraciones (entre 8,57 y 9,03 mg/l); a diferencia del pH que se presentó sumamente elevado (> 10,4) en las diluciones de NaOH. La diferencia en la desviación con respecto al control del pH entre las diluciones de NaOH en el agua sintética dura (1,658 – 2,917) y en el río Orinoco (3,959 – 4,290) demuestran que el pH sufrió un mayor aumento en el río, aun cuando las concentraciones de sodio utilizadas en el agua sintética dura fueron superiores.

Bioensayos Agudos Finales Bioensayo agudo final con agua sintética dura El control no presentó muertes y sólo en 30 mg/l de NaOH ocurrió 100 % de mortalidad a las 48 h. En ninguna concentración ocurrieron muertes durante las primeras 8 h de exposición. El mayor aumento de mortalidad se ubicó entre 25 y 28 mg/l de NaOH, de 7 (35 %) a 18 (90 %) muertes respectivamente, indicando que entre ese rango se ubica en CL50. La mortalidad en las tres concentraciones mayores fue similar (18, 20 y 19 muertes) representando más del 90 % de mortalidad (Tabla 11, Figuras 11 y 12).

La concentración de oxígeno disuelto varió entre 8,76 y 9,04 mg/l (Tabla 12). El pH aumentó conforme aumentaba la concentración de NaOH, teniendo el mínimo en el control (8,413) y el máximo en 33 mg/l NaOH (9,956), con una desviación con respecto al control de 1,159 – 1,359; se observa una diferencia de aproximadamente 1 unidad al compararlo con las mismas concentraciones preparadas en el bioensayo preliminar con agua del río Orinoco (Tabla 13).

La concentración letal media CL50 para Moina macrocopa sometida a diluciones de NaOH en medio preparado se encontró entre 25,42 – 25,72 mg/l (Tabla 14).

Bioensayo agudo final con agua del río Orinoco

No se observó mortalidad en el control, ni en la menor concentración (15 mg/l); la mayor mortalidad (90 %) ocurrió en la concentración más alta (25 mg/l) a las 48 h. No existieron muertes en ninguna solución durante las primeras 4 h del ensayo. La concentración letal media CL50 se ubico entre 20 y 23 mg/l NaOH, donde también fue el mayor aumento de mortalidad. Este rango es de menor concentración que el encontrado en el agua sintética dura (Tabla 15, Figuras 13 y 14).

Fig 14.- Porcentaje de mortalidad de Moina macrocopa presentada en Bioensayo agudo final con agua del río Orinoco a las 48 horas.

La concentración de oxígeno disuelto varió entre 8,70 y 9,01 mg/l (Tabla 16); muy similar a las variaciones encontradas en todos los bioensayos. El pH presentó gran diferencia entre el control (media de 6,5) y todas las concentraciones con NaOH (entre 10,027 y 10,554); presentando una desviación con respecto al control superior a 3,57 (Tabla 17).

Tabla 16 Valores de Oxígeno Disuelto (OD) determinados en el Bioensayo agudo final con agua del río Orinoco

Los valores de la concentración letal media CL50 calculados para Moina macrocopa sometida a diluciones de NaOH en medio natural se ubicó entre 21,52 – 22,34 mg/l.

Tabla 18 Valores de CL50 a las 48 h para individuos de Moina macrocopa expuestos a hidróxido de sodio (NaOH) en agua del río Orinoco, obtenidos a través de diferentes métodos de análisis

Comparación de los Medios de Exposición La concentración de oxígeno disuelto en todas las diluciones utilizadas de 0 a 100 mg/l de NaOH (incluyendo preliminares), en los dos medios de exposición, se comportó de manera similar ubicándose entre 8,52 y 9,04 mg/l, indicando que la cantidad de hidróxido de sodio utilizada no afectó el oxígeno disuelto en los medios. El pH aumentó en todas las soluciones donde se agrego hidróxido de sodio pero se presentó una diferencia entre el comportamiento en el agua del río Orinoco y el agua sintética dura, siendo mucho mayor el aumento de pH en el agua del río. La mayor parte de los seres vivos se desarrollan en un rango óptimo de pH entre 6,5 – 8,5 (Kemmer y McCallion, 1989). Esclapés (1999) propone un pH entre 7,0 – 8,6 para el cultivo de Daphnia magna, Daphnia pulex y Moina macrocopa. Los cambios en el pH del organismo alteran la ionización de las proteínas (Ecker et al, 1994). Bajos valores de pH producen inhibiciones en las reacciones enzimáticas de los organismos acuáticos (Kemmer y McCallion, 1989). La presencia de elevadas concentraciones de pH como las existentes en los bioensayos finales, > 9,5 en agua sintética dura y > 10 en agua del río Orinoco, pudo haber provocado un efecto negativo en las actividades enzimáticas de los individuos de Moina macrocopa. Los cladóceros poseen apéndices respiratorios en las patas y el trasporte de oxígeno resulta apoyado por la presencia de hemoglobina en la hemolinfa (Margalef, 1983). La afinidad hemoglobina-oxígeno se ve afectada por variaciones en la temperatura y el pH. El efecto Bohr describe que una disminución en el pH y un aumento en la temperatura provocan una reducción en la afinidad hemoglobina-oxígeno; mientras un aumento en el pH y una disminución de la temperatura aumenta la afinidad hemoglobina-oxígeno (Ecker et al, 1994). El aumento de pH producido en los medios por efecto del NaOH dificulta la separación de las moléculas de oxígeno de la hemolinfa de Moina macrocopa generando un déficit de energía y obstaculizando la llegada del oxígeno a los músculos. Los fenoles producen graves irritaciones oculares y cutáneas; su exposición crónica puede ocasionar la muerte por daños hepáticos y renales (Greenpeace, 2001). Rand y Petrocelli (1986) exponen que la toxicidad de un compuesto puede incrementarse bajo la presencia de otro u otros xenobióticos. Faría (2001) encontró que la mezcla de 6 hidrocarburos aromáticos policíclicos resultaron más tóxicos para mejillones Perna perna y Perna viridis que los xenobióticos o crudos utilizados en otras investigaciones, posiblemente por el efecto sinérgico producido entre los seis compuestos. FAO (1981) afirma que sustancias tóxicas tan diferentes como el fenol, el cobre y el amoníaco interaccionan de manera casi aditiva y producen efectos letales en los peces de agua dulce. La existencia de los fenoles en el agua de río puede haber actuado de manera sinérgica con el hidróxido de sodio y el pH aumentando su grado de toxicidad. Los valores de CL50 calculados por el método Moving Average, en los dos medios de exposición, no son confiables por presentarse una concentración alta que provoca menos porcentaje de muerte que una de menor concentración produciendo que los límites de confiabilidad se encuentren muy cerca. La CL50 calculada por el método Probit en el agua sintética dura, no puede utilizarse ya que la probabilidad encontrada (0,02) es menor que la mínima requerida (0,05). Los valores encontrados de CL50 de NaOH para Moina macrocopa en 48 h fueron menores en agua del río Orinoco (21,52 – 22,34 mg/l) que el agua sintética dura (25,42 – 25,72 mg/l). Posiblemente la presencia de altas concentraciones de fenoles pudo intervenir, pero el parámetro que debe haber afectado en mayor grado debe ser el aumento de pH. El control con agua de río tuvo un pH promedio de 6,5 mientras todas las concentraciones de NaOH se encontraron por encima de 10 (pH), esta significativa variación afecta los procesos osmóticos de los organismos. Merck® (1999) señala que el NaOH produce un efecto perjudicial sobre los medios acuáticos debido a que altera su pH. Al comparar las desviaciones con respecto al control calculadas en los valores de pH, se observa que las desviaciones en el agua de río (3,579 – 4,290) fueron superiores con respecto al agua sintética dura (1,159 – 2,917); aun cuando las concentraciones de NaOH utilizadas en los ensayos con agua del río Orinoco eran menores. Al preparar el agua sintética dura los 2,4 g de CaSO4.2H2O no se disolvieron completamente, aun después de someter la solución a calor. El sedimentó no disuelto se colocó en la solución total de agua sintética dura pero se despreció al momento de realizar los bioensayos para que no afectara a los organismos. Los valores de CL50 de NaOH a 48 h sobre Moina macrocopa determinados en agua sintética dura y agua del río Orinoco, se encuentran dentro del amplio rango (10 – 100 mg/l) de CL50 a 96 h mencionado por Merck® (1999) para organismos acuáticos. El hidróxido de sodio destruye las células al reaccionar con las sustancias líquidas que contiene, produciendo liberación de calor Merck® (1999). Entre mayor sea la concentración y el tiempo de exposición el daño generado es más grave. En la Tabla 19 se observan las condiciones físico – químicas de las tres lagunas naturales adyacentes a las lagunas de lodo rojo. Estas lagunas se encuentran en un alto grado de deterioro ambiental resaltando los valores de pH (> 9,9); aluminio (≥ 1,8 mg/l); color (≥ 500); hierro (hasta 9,7 mg/l) y sodio (hasta 610 mg/l).

Tomado de: Laboratorio de Ambiente C.V.G. Bauxilum.

*Según Gaceta Oficial Nº 5021. Decreto Nº 883. Aguas Tipo 4A.

Las lagunas de Cambalache, Caribe y la Aguadita están sufriendo un grave proceso de contaminación. Si comparamos los parámetros físico-químicos reportados por Ingeniería Caura (1992) con los encontrados por el Lab. Ambiente C.V.G. Bauxilum en el 2001, vemos como el pH aumento de 7,3 a 9,2 en Cambalache, de 8,5 a 10,22 en Caribe y de 8,8 a 10,56 en la Aguadita; el sodio de 8,1 a 610 mg/l en Cambalache, de 56,06 a 166 mg/l en Caribe y de 52,65 a 175mg/l en la Aguadita; el aluminio bajó de 3,86 a 1,8 mg/l en Cambalache, subió de 0,24 a 4,1 mg/l en Caribe y de 1,89 a 3,6 mg/l en la Aguadita. Muchas de las condiciones se han ido desmejorando con el paso del tiempo lo que debe haber producido una disminución de la diversidad biológica.

Ingeniería Caura (1992) identificó individuos de Moina sp. en la Aguadita (0,30 % de densidad de zooplancton) y en Cambalache (19,62 % de densidad de zooplancton). Por presentarse el mayor porcentaje de cladóceros en la laguna de Cambalache concluyeron que esta era la que disponía de las mejores condiciones físico-químicas y biológicas. Actualmente las buenas condiciones de esta laguna han decrecido significativamente, el pH es sumamente alto (9,9) y el sodio procedente presuntamente del lodo rojo se ubica en 610 mg/l, que comparado con el sodio presente en la menor concentración de NaOH (28 mg/l) utilizada con agua del río Orinoco que presentó un 100 % de mortalidad para Moina macrocopa a las 48 h, demuestra que solo pueden existir las especies más aptas y de mejor adaptación a las variaciones del ambiente. Es recomendable realizar un muestreo sistemático de zooplancton de las tres lagunas naturales para verificar si aun se encuentran presentes especies de cladóceros o si por el contrario todas han sido extintas. C.V.G. Bauxilum en asociación con la empresa francesa Pechiney está desarrollando el proyecto de deposición en seco de los residuos industriales de la planta; para así en un futuro próximo minimizar el impacto ambiental, garantizar la operación de la planta de alúmina por un período de por lo menos de 30 años, y además cumplir con todas la regulaciones ambientales vigentes (CAVSA, 2001a). Aproximadamente para el año 2005 C.V.G. Bauxilum dispondrá de un lodo rojo sumamente espeso, disminuyendo el envío de líquidos a las lagunas de lodo rojo que se irán secando paulatinamente por evaporación (CAVSA, 2001b). Además la Universidad Simón Bolívar y la empresa KD Engineering de Estados Unidos, se encuentran realizando pruebas para neutralizar el agua de las lagunas mediante la utilización de plantas pilotos, las cuales han dado resultados satisfactorios y con el estudio de factibilidad económica se determinará la construcción de una planta industrial (CAVSA, 2001b). La CL50 de NaOH para Moina macrocopa encontrada en agua del río Orinoco se adecua y asemeja más a las condiciones ambientales presentes en las lagunas naturales adyacentes a las lagunas de lodo rojo en C.V.G. Bauxilum, por lo que es el método indicado al momento de estudiar impactos puntuales y específicos de una región. Pero si por el contrario, el trabajo que se quiere realizar es pionero y universal el método ideal es con el medio de agua sintética dura; ya que este es un protocolo estandarizado y puede aplicarse a cualquier ecosistema acuático, pero ofreciendo una visión sumamente global. Además es un ensayo reproducible en cualquier lugar y tiempo. En el ambiente natural, debido posiblemente a un efecto sinérgico con la presencia de fenoles, un aumento de pH podría causar grandes mortalidades, como ocurre con la especie Moina macrocopa.