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Escherichia Coli k12

Enviado por Juan Arturo Díaz

     

     

    Resumen

    Dos grupos de genes, nar (GHJI) y mol (moa, mob, mod, moe, mog y molR), codifican para los componentes estructurales de la enzima inducible Nitrato Reductasa Respiratoria A (NRA). En estudios previos, se observó que la mutación narC-8 bloqueaba la manifestación del carácter Lac+ conferido por la fusión transcripcional moa::Iac. Para determinar el posible papel controlar del operón narC, se caracterizó otra mutación independiente y fue clasificada como narC-MM78. Cepas isogénicas mutantes, doble y simple, fueron construidas y se observó que la referida mutación parece ejercer el mismo efecto que narC-MM78. Cepas isogénicas mutantes, doble y simple, fueron construidas y se observó que la referida mutación parece ejercer el mismo efecto que narC-8. Las condiciones de cultivo que controlan la biosíntesis de la NRA, no lograron suprimirlo fenotípicamente aún adicionando concentraciones variables de nitrato, molibdato, nitrito, azida o clorato. Sin embargo, cuando la cepa de fusión era narC+, esas mismas condiciones modularon la manifestación del carácter Lac+. Los resultados obtenidos permiten proponer un papel controlador de narC+ activando la expresión de moa. Esa acción seria ejercida dentro de un sistema coordinado de circuitos de control fisiológico y genético, el cual mantendría un balance adecuado en la biosintesis de la NRA durante la respiración anaeróbica del nitrato, en E. coli K12.

    Palabras claves: Nit- pleiotrópicos; operón nar; regulación moa; regulación nar-moa; E. coli.

     

    Abstract

    Characterization of a nar mutation and its effect on the transcriptional expression of a moa::lac operon fusion in Escherichia coli K12

    Two gene groups, narC (GHJI) and mol (moa, mob, moe, mog y molR), encode for the structural compenents of the respiratory nitrate reductase A (NRA) inductible enzyme. In previous studies it was observed that narC-8 mutation blocked the Lac+ character expression confered by the transcriptional moa::lac fusion. In order to determine the posible controler role of the narC operon, another independent mutation was characterized and was classified as narC-MM78. Double and simple mutant isogenic strains were constructed and it was observed that the mutation could have the same effect as narC-8. The culture conditions controlling the NRA biosynthesis did not suppress it phenotipically even when variable concentrations of nitrate, molybdate, nitrate, azide or clorate were added. However, the same conditions modulated the Lac+ character expression when the fusion strain was nar+. The results permit to propose a nar+ controler role by activating the moa expression. That action could be carried out in a coordinated system of physiological and genetic control circuits, that could keep an adequate balance in the NRA biosynthesis during the anaerobic nitrate respiration, in E. coli K12.

    Key words: Nit- pleiotropic; nar operon; moa regulafion; nar-moa regulafion; E. coli

     

    INTRODUCCIÓN

    La reducción del nitrato a nitrito es un proceso respiratorio inducible que juega un papel central en el metabolis mo anaeróbico de las bacterias entéricas y desempeña un control epigenético clave en la regulación de otras vías metabólicas de oxidorreducción inducibles (Ingledew and Poole 1984). La Nitrato Reductasa A (NRA) de E. coli es la enzima terminal de la cadena respiratoria y requiere de un molibdocofactor (MoCo) para su activación catalítica (Amy and Rajagopalan 1979, Giordano et al. 1990, Miller and Amy 1983; Ruíz- Herrera and DeMoss 1969, Stewart 1988, Stewart and MacGregor 1982, Wootton et al. 1991). Los genes nar (anteriormente chlC) (Puig and Azoulay 1967, Stewart and MacGregor 1982) mapean en el minuto 27 sobre el cromosoma de E. coli (Bachmann 1990) y codifican para:

    i. la apoNRA (operón narGHJI) (Bonnefoy-Orth et al. 1981, Edwards et al. 1983, Sodergren and DeMoss 1988);

    ii reguladores transcripcionales del operón narGHJI (operón narX, L) (Li et al. 1994, Walker and DeMoss 1993); iii. y una proteína que media la exportación de nitritos (gen nark) (Rowe et al. 1994). Otros genes renombrados mol (moa, mob, mod, moe, mog) (anteriores chlA, B, D, E y G) (Bachmann 1990, Shanmugan et al. 1992), además del moiR, participan en el metabolismo del MoCo (Amy and Rajagopalan 1979, Amy 1981, Jhonnson et al. 1984, Jhonson and Rajagopalan 1987a, 1987b; Lee et al. 1990, Miller and Amy 1983, Pitterle, Rajagopalan 1989, Rivers et al. 1993).

    Las mutaciones en el operón narGHJI confieren el fenotipo Nit- (defecto en la reducción del nitrato a nitrito), mientras que en los genes mol ocasiona la pérdida pleiotrópica en la actividad de distintas molibdoenzimas (reductasas y deshidrogenasas), por ejm. la NRA y la Formiato Deshidrogenasa del sistema Formiato Hidrógeno Liasa (fenotipo Nit- Gas-) (Puig, Azoulay 1967, Stewart 1988). Los primeros mutantes Nit- fueron seleccionados por resistencia al clorato (Piéchaud et al. 1969), pero en su mayoría las mutaciones son pleiotrópicas (Ball, Ortega 1985, Casse 1970, Fiimmel and Haddock 1979, Miller and Amy 1983, Ortega de L. 1982, Puig and Azoulay 1967, Stewart and MacGregor 1982); no obstante, recientemente fue desarrollado un método nuevo referido como TNC que permite ampliar la variedad de genes mutados (Ortega de L., 1994). En la biosíntesis de la apoNRA, el nitrato y la anaerobiosis, además de productos codificados por los genes reguladores narL, fnr, him y mol son requeridos para la expresión transcripcional máxima del operón naGHJI (Chippauz et al. 1981, Pascal and Chippaux 1982, Ruiz-Herrera and Salas Vargas 1976, Shroder and Darie 1993, Spiro and Guest 1990, Stewart 1883), la azida y el molibdato modulan los niveles de biosíntesis (Chippauz and Pichinotty 1970, Giordano et al. 1980). Por el contrario, se conoce muy poco sobre la regulación de la biosíntesis del MoCo y la expresión de los genes mol (Miller and Amy 1983, Miller et al. 1987, Pascal and Chippaux 1982, Stewart 1988).

    En estudios con fusiones traduccionales moa:lacZ, la expresión del operón moa (anteriormente chlA) (Bachmann 1990, Shanmugan et al. 1992) fue sensible al control negativo mediado por la aerobiosis y posiblemente por el MoCo. (Baker and Boxer 1991). Otros estudios realizados con una fusión trascripcional moa::lac (Ortega de L. 1989), la composición del medio y el estado fisiológico del cultivo actuaban como moduladores (Ortega de L. 1994), igualmente permitieron evidenciar por primera vez que la presencia de una mutación nar-, la llamada chlC-8 (Puig et al. 1969b), bloqueaba totalmente la expresión de la fusión (fenotipo Lac-), detectado por incapacidad de crecer y fermentar la lactosa y ausencia de actividad enzimática galactosidasa (Ortega de L., resultados inéditos). El presente trabajo está dirigido a caracterizar una nueva mutación, clasificada preliminarmente como nar-, la nar-MM78 (Ball 1986, Ball y Ortega de L. 1985), y estudiar su posible efecto sobre la expresión de la fusión transcripcional moa::lac, en células crecidas bajo diferentes tratamientos.

     

    MATERIALES Y MÉTODOS 1. Cepas y condiciones de crecimiento.

    Las cepas bacterianas de E. coli y de fago se encuentran relacionadas en la tabla 1. Las bacterias se cultivaron a 300 C. Los cultivos aeróbicos fueron agitados en fiolas de 250 ml conteniendo 10 ml de medio; los anaeróbicos se prepararon por inoculación en tubos totalmente llenos con el medio y sin agitación; cuando fue necesario se incubó en anaerobiosis estricta bajo atmósfera de hidrógeno y bióxido de carbono, utilizando el sistema Gas-Pack.

     

    2. Medios de cultivo.

    Las sales de medio mínimo contienen (por litro): 5.98g de KH2PO4; 10.18 g de K2HPO4. 3H20; 1.12g de Na3H5C6O7 . 2H20; 0.31g de MgSO4. 6H20 y 2,0 g de (NH4) 2SO4. Los amino-ácidos se agregaron a 40 ug/l. Cuando se indicó, las sales fueron suplementadas con KNO3 (Nit), KNO2 (Nir), NaN3 (Azi), K2MO4 (Mob), KC1O3 (Chl) a la concentración señalada en el texto. La composición de los medios ricos (LB, nutritivo y diferencial) fue reportada (Miller 1972).

    El medio agar MNT contiene (por litro): 40g de MacConkey base, 2.5g de KNO3, 4g de glucosa y l0g de trimetil amina N-óxido (Stewart and MacGregor 982). El medio agar diferencial TNC contiene (por litro): sales de medio mínimo agarizadas suplementadas con 0,lg de cloruro de 2, 3, 5 trifenil tetrazolio (TTC), 2 g de KNO3, 2g de casaminoácidos, 2 g de glucosa y vitamina B1 (Ortega de L. 1994); se adicionó triptófano según el requerimiento de la cepa bacteriana. Cuando fue necesario se utilizó (por mililitro: 30 g de kanamicina (Kn), 15 g de tetraciclina (Tc), 50 g de ampicilina (Ap) y 40 g de 5-bromo -4-cloro-3 indolil--D-galactósido (X-Gal). Como fuente de carbono en los medios sintéticos se utilizó la glucosa, galactosa y lactosa; g/1 y 1 g/l en los cultivos anaeróbicos y aeróbicos, respectivamente.

     

    3. Técnicas genéticas.

    La transducción generalizada mediada por el fago P1 vir se realizó siguiendo el procedimiento de Lennox previamente descrito (Miller 1972). La mezcla de transducción se lavó por centrifugación y concentrada diez veces antes de sembraren superficie sobre los medios de aislamiento. Clones transductantes independientes fueron reaislados en el mismo medio y sometidos a los ensayos fenotípicos y fisiológicos para caracterizarlos. El grado de ligamiento de la mutación con el marcador de transductantes con respecto al total de los clones ensayados.

     

     

    4. Caracterización de las cepas bacterianas.

    Ensayos fenotípicos. Los requerimientos nutricionales, fermentación de azúcares y resistencia a drogas fueron ensayados según descrito (Miller, 1972). El método de Stewart y MacGregor (1982) se utilizó para distinguir entre grupos de mutaciones nar; el tamaño y color de las colonias evaluados por crecimiento en el medio MNT, bajo anaerobiosis estricta; la sensibilidad al clorato fue valorada por crecimiento con diferentes concentraciones de clorato utilizando el método de Piéchaud et al. (1969) modificado por Ortega de L. (1982).

     

    5. Ensayos fisiológicos.

    5. 1. Reducción fisiológica del nitrato (Nit+), se valoró espectrototompréticamente agregando reactivo de nitritos a cultivos crecidos anaeróbicamente con caldo nutritivo glucosado conteniendo nitrato (Piéchaud et al. 1969). También en medio sólido ensayando la producción de nitritos a partir de colonias previamente crecidas por rayado sobre agar nutritivo glucosado; un papel filtro impregnado con nitrato se colocó sobre los rayados y después de 20 seg. fue reemplazado por otro impregnado con reactivo de nitritos (Chippaux et al. 1981);

    5.2. Reversión fenotipica por molibdato, se verificó la acumulación de nitritos, como se indica en el punto anterior, pero el caldo fue suplementado con 10-3 M de molibdato (Glaser and DeMoss 1971),

    5.3. Aparición de colonias rojas (TNC+), por crecimiento en superficie sobre el medio diferencial TNC (tetrazolio, nitrato, casaminoácidos) (Ortega de L. 1994), 5.4 Liberación de gas (Gas+), se verificó la presencia de burbujas en tubos durham, después de una noche de crecimiento anaeróbico en caldo nutritivo glucosa (Puig et al. 1969).

     

    6. Ensayos enzimáticos.

    6.1. La actividad ßgalactosidasa (ßGal), se estimó en células enteras previamente tratadas con cloramfenicol (50 µg/ml) y mantenidas en frío hasta el momento de realizar el ensayo; se siguió la hidrólisis del -nitro fenil-ß- D-galactopiranósido (ONPG), y los valores fueron expresados como Unidades Miller (Miller 1972).

    6.2. La actividad específica NR, fue estimada en células enteras inducidas durante una noche; la reducción del nitrato a nitrito se valoró espectrofotompréticamente en cultivos crecidos anaeróbicamente una noche con glucosa y en una mezcla de reacción con formiato y bencil viológeno reducido (BVH), respectivamente (Ruiz-Herrera, DeMoss 1969); las proteínas fueron determinadas por el método de Lowry modificado por Markwell et al. (1978).

     

    RESULTADOS

     

    Caracterización de la mutación nar-MM78 Las mutaciones en cualquiera de los genes nar confieren el fenotipo no pleiotrópico Nit- Gas+ (Puig and Azoulay 1967) y son TNC+ (Fimmel and Haddock 1979; Ortega de L. 1994). Para el presente trabajo se escogió la cepa MM78, que fue aislada como un clón independiente TcR ChlR, después de la mutagénesis por translocación del transposón Tn10 portado por el fago NK55 y caracterizada preliminarmente como nar-MM78 (Ball y Ortega de L. 1985); presentó el fenotipo Nit- TNC+ y además, conservó la actividad fumarato reductasa (Frd+), lo cual descartaba la presencia de una mutación fnr que también confiere el fenotipo no pleiotrópico (Lambden and Guest 1976).

    Se determinó la actividad enzimática NR asociada con diferentes donadores de electrones (Tabla 2). Los valores obtenidos para la cepa MM78 se corresponden con la cepa mutante de referencia LCB426 que contiene la mutación chl C- 8 (Puig et al. 1969b). Estos resultados muestran que el fenotipo Nit- de la MM78 sé corresponde con la cepa mutante de referencia LCB426 que contiene la mutación chlC-8 (Puig et al. 1969b) que el fenotipo Nit- de la MM78 es atribuible a una mutación nar y el factor de disminución en la actividad BV-NR, respecto a la cepa parental silvestre Pc90, fue similar al reportado para una mutación narG (Stewart and MacGregor 1982).

    El método desarrollado por Stewart y MacGregor (1982) se utilizó para determinar preliminarmente la localización de la mutación dentro de la región nar, comparado su comportamiento con distintas cepas control genéticamente caracterizadas (Tabla 1). Se analizaron el tamaño y color de las colonias y la sensibilidad a diferentes concentraciones de clorato, pero en ninguno de los ensayos realizados los resultados obtenidos se correspondieron con lo esperado (Tabla 3).

     

    Tabla 3. Actividad enzimática NR con diferentes donadores de electrones. a Los valores se expresaron como µmoles de NO2/min/mg proteínas. b Variación relativa de actividad específica MM78/PC90

    La localización cromosomal y el origen de la mutación nar-M778 (espontáneo o por inserción del transposón Tn 10).

    Se realizaron experimentos de transducción mediados por el fago P1 vir para determinar la localización y el origen de la mutación nar (espontáneo o por inserción del transposón Tn 10)y además construir cepas isogénicas simples y dobles mutantes conteniendo la fusión transcripcional moa::lac. La cepa MM78 se utilizó como donante del fenotipo TNC+ a la receptora M120 (Tabla 4, cruce 1) y se observó un 28% de contransducción con Trp+ como marcador de selección; todos los TNC+ fueron Nit-. Este valor cae dentro del rango esperado de 20 – 50% para mutaciones nar (Fimmel and Haddock 1979), Guest 1969, Puig et al. 1969b, Venables and Guest 1968), lo cual comprueba la localización originalmente propuesta. Ninguno de los transductantes Trp+ Nit- analizados recibió el fenotipo TcR, indicando el origen espontáneo de la mutación nar-MM78, y descartando así la presencia de una inserción nar::Tn10, en cuyo caso el ligamiento esperado entre los fenotipos TNC+ y TcR debió ser del 100%. Ambos hechos fueron corroborados en un segundo cruce (Tabla 4, cruce 2) utilizando KnR como marcador de selección más proximal, conferido por un transposón híbrido insertado en la posición zch-31 17::Tn10KnR a los 27', 25" del cromosoma de la cepa de E. Coli CAG1855l (Singer et. al. 1989), entre la región nar (27') y el operón trp (28') (Bachmann 1990). La cepa MM78 fue utilizada como receptora y el 67% de los KnR fueron TNC- y Nit+; además todos ellos conservaron el fenotipo TcR, contrario a los esperado en una inserción nar::Tnl0.

     

    Tabla 4. Resultados de ligamiento. a Sólo se indicaron los genotipos y fenotipos considerados en cada cruce. Todos los clones TNC+ y TNC- fueron Nit- y Nit+, respectivamente.

    Efecto de la mutación narMM78 sobre la manifestación del fenotipo lac positivo conferido por la fusión moa::lac.

    Cepas con la doble mutación moa-MA25::lac nar MM78 se construyeron utilizando como receptora a uno de los clones transductantes Trp+ TNC+ obtenidos en el primer cruce (Tabla 4, cruce 1), el denominado JM1 , y la cepa MA25 como donante de la fusión (Tabla 4, cruce 3). El 20% de los transductantes aislados como Gal+ se hicieron Gas-, debido al efecto pleiotrópico dominante de la mutación moa (Puig and Azoulay, 1967) y ninguno de ellos revirtió fenotípicamente al carácter Nit+ por crecimiento con molibdato (Glaser and DeMoss 1971). Este valor porcentual también se observó cuando esa misma fusión fue contransducida con Gal+ a la cepa nar+, obteniéndose la is ogénica simple mutante M128 (Ortega de L. 1982). Por el contrario, todas las cepas con la doble mutación moa::lac nar-MM78 aquí obtenidas se comportaron como Lac-, siendo incapaces de crecer y fermentar la lactosa y dar colonias azules en el medio XGal, indis tintamente de las condiciones de aeración. Por lo tanto, los resultados sugieren que la mutación nar-MM78 está afectando negativamente la expresión de los genes lac bajo el control del promotor pmoa, igual a lo observado previamente con la mutación chlC-8 (Ortega de L., resultados inéditos) donada por la cepa LcB426 (Puig et al. 1969b).

    En un cruce siguiente se verificó genéticamente la presencia e integridad funcional de la fusión moa::lac (Tabla 3, cruce 4). Uno de los clones doble mutante (Tabla 4, cruce 3), denominado JM5, fue utilizado como donante para contrasducir la fusión a la receptora isogénica M120 nar+. El 20% de los transductantes Gal+ recibieron simultáneamente loS fenotipos TNC+ Nit- Gas- Lac+ conferidos por la fusión original moa- MA25::lac (el clón JM15 fue recuperado para estudios subsiguientes), descartándose la posibilidad de que el fenotipo Lac- de la cepa JM5 se hubiese originado por alteración en la integridad física del fragmento que contiene la fusión, ocurrida durante el proceso de transducción.

    Influencia mediada por factores fisiológicos.

    Era de interés investigar la posibilidad de revertir fenotípicamente el efecto de la mutación nar-MM78 sobre la expresión de la fusión. Los siguientes factores fisiológicos fueron evaluados individualmente, ensayando concentraciones graduales: i. El nitrato (Nit), molibdato (Mob) y asida (Azi) que controlan la biosíntesis de la NRA (Stewart, 1988); ii. el clorato (Chl), utilizado en la selección de mutantes Nit-, y iii. el nitrito (Nir), por ser el producto resultante de la reducción del nitrato (Puig and Azoulay 1967).

    El crecimiento anaeróbico de la cepa doble mutante JM5, a expensas de lactosa, fue cuantificado comparando con cepas isogénicas de referencia: dos con la simple mutación moa::lac (JM15, Ml 28) y una con la deleción ?lac (M120) (Tabla 5). Ninguna de las condiciones ensayadas permitió el crecimiento detectable en la doble

     

    Tabla 5. Expresión anaeróbica de la fusión moa::lac, ensayando el crecimiento a expensas de lactosas en cultivos sometidos a diferentes tratamientos.

    a La lactosa (Lac), glucosa (Glu) y galactosa (Gal) fueron adicionadas a una concentración final de 2 g/l. Otras concentraciones variables de Molibdato (Mob), Nitrito (nir), Azida(Azi), Nitrato (Nit) y Clorato (Chl) también fueron ensayadas (Ver leyenda de la Fig. 1), pero los resultados se mantuvieron invariables a las 24 y 48 hs. de incubación. Crecimiento celular (A 600) mutante, comportándose como el control que presenta la delación ?lac, ni tampoco afectó el MedULA, Revista de la Facultad de Medicina, Universidad de los Andes. Vol. 4 Nº 1-4. 1995. Mérida, Venezuela crecimiento de las cepas simple mutantes. La incapacidad de utilizar la lactosa no está relacionada con alguna alteración en el metabolismo anaeróbico del piruvato, la cual es conferida por una mutación en el gen ana ligado al operón narGHJI (Bachman 1990, Pascal et al. 1981), ya que los valores alcanzados por la doble mutante son muy similares a los controles creciendo anaeróbicamente a expensas de glucosa (Tabla 5). La expresión anaeróbica de la fusión moa::lac también fue evaluada cuantificando la actividad enzimática ßGal, pero tampoco se detectó actividad en la doble mutante, igual que el control con la delación ?lac. No obstante, en el caso de la simple mutante M128 todos los factores ensayados influyeron parcialmente sobre la expresión (Fig. 1); siendo favorecida con el incremento en las concentraciones de Mob, Nit y Chl, respectivamente, contrario al efecto ejercido por Nir y Azi.

    Por último se estudió el efecto de la edad del cultivo sobre la expresión anaeróbica de la fusión a las 12 "24 h. de incubación (Fig. 2). La cepa doble mutante JM5 no presentó crecimiento ni actividad ßGal detectables. En el caso de la simple mutante JM15, que contiene la fusión donada por la doble mutante JM5 (Tabla 1), los valores de actividad permanecieron invariables a las 24 h. de incubación, y fueron comparables a los cuantificados en la cepa Ml 28. Estos resultados corroboraron que la doble mutante JM5 contiene una fusión potencialmente funcional y que el fenotipo Lac- es atribuible al efecto negativo de la mutación nar-MM78 sobre la expresión del promotor pmoa. Figura 1. El número de las barras indica las concentraciones ensayadas de Molibdato (Mob), Nitrito (Nir), Azida (azi), Nitrato (Nit) y Clorato (Chl), en el orden creciente (mM): 1(10- 4), 2(10-2), 3(10-1) y 4(1); 5(20), 6(30), 7(40) y 8(200); 9(4), 10(8), 11(12), 12(16) y 13(80). El asterisco indica la concentración utilizada como referencia. La actividad ßGal se cuantificó a las 24 hs. de incubación.

     

     

    DISCUSIÓN

    La Nitrato Reductasa A (NRA) de E. coli está constituida por una apoproteína y un molibocofactor (MoCo) requerido para su activación catalítica. Los genes nar y mol participan en la biosíntesis de la apoNR y del MoCo, respectivamente (Shanmugan et al. 1992, Stewart 1988).

    En una investigación previa pudo observarse por primera vez que una mutación dentro de la región nar, identificada como ChlC-8 (Puig et al. 1969), fue capaz de bloquear totalmente la Figura 2. La actividad Gal (unidades Miller) se cuantifico a las 12 (£) y 24 hs. (///) de incubación. El valor entre paréntesis indica el crecimiento celular (A600) expresión de una fusión transcripcional moa- MA25::lac (Ortega de L. 1982). En el presente trabajo se escogió una mutación independiente clasificada fisiológicamente como nar-MM78 (TNC+ Nit- Gas+) (Ball 1986, Ball y Ortega de L. 1985) para investigar su capacidad de ocasionar un efecto similar.

    Se realizaron diferentes análisis para determinar la localización y el origen de la mutación nar- MM78. Se aplicó el método de Stewart y MacGregor (1982) para distinguir mutaciones entre grupos de genes nar, pero los resultados de los distintos ensayos siempre difirieron con lo esperado, y, por lo tanto, no se pudo obtener la información deseada. El factor de disminución de actividad especifica BV-NRA, con respecto a la cepa parental isogénica, fue similar al reportado MedULA, Revista de la Facultad de Medicina, Universidad de los Andes. Vol. 4 Nº 1-4. 1995. Mérida, Venezuela para mutaciones en el cistrón narG (Stewart and MacGregor 1982), descartando la posibilidad de una mutación en el gen fnr, en cuyo caso dicha actividad estaría totalmente ausente (Schroder and Darie 1993).

    Los análisis genéticos por ligamiento confirmaron la localización de la mutación dentro de la región nar. Se trata de una mutación espontánea, descartando la posibilidad de una inserción nar:: Tn10. Cuando esa mutación estuvo presente en una cepa que se le contrasdujo la fusión transcripcional moa::lac (Lac+), los dobles mutantes obtenidos fueron fenotípicamente Lac- Este resultado no es atribuible a la ausencia y/o alteración estructural de la fusión, ya que el doble mutante JM5 podía transferir el fenotipo Lac+ ligado a Gal+ y el porcentaje de cotransducción fue igual al esperado. Por lo tanto, la mutación nar- MM78, tal como la chlC-8 (Ortega de L., resultados inéditos), bloquea totalmente la expresión de la fusión transcripcional moa- MA25::lac.

    La influencia de diferentes factores fisiológicos fue valorada individualmente, cuantificando el crecimiento celular y la biosíntesis acumulativa de ßGal. Pudo observarse que la expresión anaeróbica de la fusión bajo estudio fue controlada por factores que influyen sobre la biosíntesis de la NRA (nitrato, molibdato y asida), sólo cuando la región nar se encontraba en estado silvestre, ya que no fueron capaces de antagonizar el efecto negativo ejercido por la mutación nar-MM78. Estos resultados sugieren la participación de un circuito de control fisiológico que regularía conjuntamente la biosíntesis de la apoNRA y del MoCo, manteniendo un balance adecuado en la concentración de NRA requerida por el metabolismo celular. Los resultados confirmaron el posible papel del clorato como factor de control que modula la regulación anaeróbica del operón moa y en consecuencia afectaría indirectamente la biosíntesis de la NRA y el resto de molibdoenzimas que comparten el mismo MoCo; el papel modulador del clorato fue reportado previamente para la fusión bajo estudio moa-MA25::lac, en experimentos de cinética con cultivos creciendo aeróbicamente en medio sintético (Ortega de L. 1985).

    El efecto fuertemente negativo de las mutaciones nar-MM78 y chlC-8, descarta la participación de la segunda Nitrato Reductasa, denominada NRZ (Barret and Rigs 1982; Blasco et al. 1992, Bonnefoy-Orth et al.1987, Iobbi el al. 1987), como factor de control genético sobre la expresión transcripcional de la fusión bajo estudio, además es un hallazgo difícil de explicar en una cepa simple mutante nar– moa+. Productos codificados por los operones moa y moe participan en la biosíntesis de la molibdopterina (MPT), durante las primeras etapas en el metabolismo del MoCo (Jhonson and Rajagopalan 1987a, 1987b,, Wootton et al. 1991) por lo tanto, sería de esperar que las cepas mutantes Nar- estuviesen afectadas pleiotrópicamente en la actividad de las distintas molib-doenzimas que requieren del MoCo, pero esto no sucede. En consecuencia, los resultados aquí obtenidos pudieran indicar la participación de un control autógeno positivo de moa::lac nar, este tipo de control fue reportado previamente en estudios con cepas de fusión traduccional moa::lac (Baker and Boxer 1991). Por lo tanto, como hipótesis de trabajo, puede considerarse la participación de productos Nar+ y Moa+ que actuarían, indistintamente y en fórma sinérgica; en este último caso se alcanzarían los niveles de expresión máxima del operón moa; diferentes niveles de expresión fueron reportados previamente para la fusión bajo estudio moa-MA25::lac, en experimentos de cinética con cultivos creciendo bajo diferentes condiciones de aeración (aeróbicas, anaeróbicas y de transición) (Ortega de L. 1985). Esta hipótesis considera la participación de un circuito de control genético que complementaría al fisiológico propuesto al inicio de la discusión, todo ello como un mecanismo que mantiene un balance adecuado en la concentración de NRA requerida por el metabolismo celular, durante la respiración anaeróbica del nitrato.

     

    CONCLUSIONES

    1.- La mutación no pleiotrópica nar-MM78 es de origen espontáneo y está localizada en el cistrón narGHJI.

    2.- La presencia de la mutación nar-MM78 bloqueó la expresión de una fusión transcripcional moa::lac, indistintamente de las condiciones de aeración.

    3.- Factores fisiológicos que controlan la expresión transcripcional del operón narGHJI no antagonizaron el efecto negativo de la mutación nar-MM78, en cultivos crecidos en medio sintético, por el contrario, controlaron la expresión de la fusión moa:lac en una cepa isogénica nar+. Este mismo comportamiento fue observado al ensayar los efectos individuales del clorato y nitrito.

    4.- El efecto fuertemente negativo de las mutaciones nar-MM78 y chlC-8 en las cepas doble mutantes, permite sugerir que productos Nar+ y Mol+, individualmente y/o en forma sinérgica, pudieran controlan la expresión transcripcional del operón moa en E. coliK12.

     

    AGRADECIMIENTOS

    Se le agradece al Dr. Marck Chippaux (CNRS. LCB, Marsella, Francia) su amabilidad por las cepas bacterianas suministradas y los comentarios sobre este trabajo. Al Dr. John DeMoss (Universidad de Texas, Houston, USA) por su evaluación de los resultados experimentales. Nos complace reconocer el apoyo financiero aportado por el Consejo de Desarrollo Científico, Humanístico y Tecnológico de la Universidad de los Andes (CDCHT – ULA) para realizar la presente investigación.

     

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    Juan Arturo Díaz

    En MedULA, Revista de la Facultad de Medicina, Universidad de los Andes. Vol. 4 Nº 1-4. 1995. Mérida, Venezuela Mariemma Ortega de López y Departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad de Los Andes Venezuela. Mérida