Efecto del enriquecimiento de un suelo agrícola sobre la superviviencia y germinación de esporas de Bacillus thuringiensi

1. Resumen
2. Introducción y antecedentes
3. Materiales y métodos
4. Resultados y discusión
5. Literatura citada
6. Anexo

RESUMEN

La bacteria formadora de esporas Gram positiva, Bacillus thuringiensis (Bt) se usa en el control de insectos-plaga de los ordenes Diptera, Coleoptera y Lepidoptera, de cultivos agrícolas, granos en almacén y larvas de mosquitos vectores de enfermedades humanas en agua. Se le supone nativa del suelo, pero se duda que sus esporas supervivan en este sitio o incluso se reproduzcan en ese habith. El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto de la concentración de dextrosa y extracto de levadura, sobre la germinación de esporas de Bt. La supervivencia y germinación de las esporas se determinó or pasteurización de las muestras de suelo y siembra en agar nutritivo.

Los resultados indican que esporas de Bt GM-1, GM-2 supervivieron y germinaron más que las esporas de colección HD-1. La cual fue aparentemente más exigente nutricionalmente, puesto para germinar requirieron de dextrosa y extracto de levadura, ello sugiere una posible relación con su hábitat original de aislamiento, en donde las GM nativas del suelo, usaron materia orgánica de ese ambiente mientras que la HD-1 aislada de insectos necesitó nutrientes más específicos para la germinación de sus esporas.

Palabras clave: biopesticida, control biológico, demanda nutricional

Effect amendment of soil on the survival and germination spores of Bacillus thuringiensis.

SUMMARY

The effect of amendment of sterile soil with different concentrations of dextrose 1.0%, 3.0% and 5.0% (w/w) and 0.01% (w/w) of yeast extract on the survival and germination of spore of Bacillus thuringiensis GM-1, GM-2, and HD were inoculated alone in sterile soil. The survival and germination of spores were determined by pasteurization of the soil samples on nutrient agar. The results showed differences between the strains tested. The spores of strains GM-1, GM-2 and HD-1 had better capacity of survival and germination than the spores of strain HD-1 which shawed high nutritional demand, since the spores of strain HD-1 requiered, to germinate of dextrose and yeast extract. This suggest that the nutritional exigency observed may be related with its original habitat of isolation, since the GM's strains are native from soils were apparently capables to utilizate the assimilable part of the organic material of the soil. The HD-1 isolated from insects require specific nutrient for geminating its spore.

Key words: biopesticide, biological control, demand nutriocional.

INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES

El biopesticidas a base de Bacillus thuringiensis (Bt) es una alternativa para evitar el deterioro ecológico, es una bacteria formadora de esporas, Gram Positivo que sintetiza un cuerpo paraesporal ó cristal de proteína (δ-endotoxina) durante el proceso de esporulación (García et al, 2000). La mezcla cristal-espora es tóxica contra insectos-plaga de los orden: Coleoptera, Diptera y Lepidoptera. Esté cristal no causa daño en humanos, animales ó plantas, es biodegradable e induce manejado con inteligencia (rotación de variedades de Bt) un mínimo de desarrollo de resistencia en insectos (Dulmage y Aizawa, 1982; Lambert y Perferoen, 1992).

Su aplicación consiste en la aspersión del complejo espora-cristal sobre las hojas de las plantas o en la superficie del agua, no tiene efecto residual, pero ello debe reaplicarse en cada ciclo agrícola (Sánchez-Yáñez y Peña-Cabriales, 2000; Luna-Olvera y Peña-Cabriales, 1993), a causa de la incapacidad de sus esporas para supervivir y eventualmente germinar con los estímulos fisicoquímicos del ambiente en cuestión, incluso como célula vegetativa antes de esporular (Medrano et al, 2000).

Por lo anterior el objetivo de esta investigación fue determinar el efecto del enriquecimiento de dextrosa y extracto de levadura sobre la supervivencia y germinación de esporas de B. thuringiensis en un suelo esterilizado.

MATERIALES Y MÉTODOS

I. Origen, de los aislados y cepas de Bacillus thuringiensis.

Se utilizaron tres de Bt. denominados GM-1 y GM-2, recuperadas de suelos del estado de Nuevo León y otro conocido como HD-1, proveniente de un lepidóptero insecto-plaga de almacén de granos aislado y donado para este trabajo por el Dr. Howard T. Dulmage del USDA, Waco, Texas, E.E.U.U.

Los aislados se conservaron en refrigeración a 10° C en agar nutritivo o agar triptosa fosfato pH 7.0.

II. Suelo agrícola.

Se colectó un suelo agrícola a una profundidad de 15-30 cm, del municipio de Guadalupe, N.L., el que se sometió a análisis físico-químico: pH, materia orgánica, textura etc. (Ortiz y Ortiz, 1980).

III. Diseño Experimental.

Porciones de 100 g del suelo agrícola de Guadalupe, Nuevo León, México, se colocaron en recipientes de cartón y se esterilizaron a 121° C por dos horas. Luego el pH del suelo se ajustó a 7.0 con HCL 0.1N. Entonces e suelo se enriquecido con dextrosa (QB, Baker) a nivel de concentración de 1, a 3% (p/p). Además se adicionó el extracto de levadura (Difco) se agregó al 0.01% (p/p) como factor de crecimiento, la humedad se ajusto a 60% con agua destilada. Se dejó el mimo suelo sin enriquecer ni inocular Bt como control, en este caso dada la necesidad nutricional de Bt sólo se ajustó en el pH y la humedad indicada.

IV. Preparación del inóculo de Bt para el suelo.

Las esporas de Bt se cosecharon de un cultivo de 72 h en caldo nutritivo (Bioxon), se suspendieron en solución salina (NaCl 0.85%), se pasteurizaron a 80° C/10 min. Las esporas se lavaron por centrifugación tres veces a 3000 rpm/15 min. La suspensión de esporas se ajusto a la turbidez del tubo No. 1 de Mac Farland y diluyó hasta 3.0X103 esporas/ml, concentración que se inóculo en el suelo agrícola (Pruett et al.,1980).

V. Recuperación de las esporas de Bt inoculadas en el suelo.

Se realizaron muestreos diarios del suelo agrícola y el suelo sin Bt usado como control absoluto. Para determinar la supervivencia y germinación de las esporas, se tomaron 5.0 g. de cada suelo y se suspendieron en 45 ml. de solución salina esterilizada pH 7.0.

Se pasteurizaron a 80° C/10 min, y cuando fue necesario se realizaron diluciones para determinar su densidad en agar nutritivo. Se reporto el número de esporas viables/g de suelo seco agrícola.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

I. Análisis fisicoquímico del suelo.

El suelo de acuerdo con el análisis, se clasificó como franco arenoso con un 93.16% de arena, pH 8.0 alcalino y extremadamente rico en materia orgánica con un valore de 5.2% (Ortiz y Ortiz 1980).

II. Efecto del enriquecimiento del suelo con dextrosa y extracto de levadura sobre la supervivencia y germinación de las esporas de Bt.

En el cuadro1 se muestra la supervivencia de las esporas Bt GM-1, en el cual se detectó que estas germinaron con los nutrientes del suelo, probablemente derivados de la materia orgánica por el proceso de esterilización al que se sometió, en contraste con los reportes de Petras y Casida (1985), West et al (1985) sobre la incapacidad de las esporas Bt que por principio perdieron rápidamente su viabilidad en un suelo agrícola no esterilizado.

Cuando el suelo se enriqueció con dextrosa en concentración de 1 y 3% se observó una germinación de las esporas similar a la detectada en el suelo sin enriquecer, y que se utilizó como control relativo, lo que sugiere que la materia orgánica del suelo no enriquecido contiene compuestos de carbono, probablemente ácidos orgánicos asimilables para Bt como la dextrosa como lo señalan, Sekijima et al (1977) y Luna y Peña-Cabriales (1989) inferior a la germinación de las esporas de Bt cuando se enriqueció con dextrosa al 5%.

Como se observa en el cuadro 2 en donde las esporas de Bt GM-1 mostraron la máxima germinación con los nutrientes disponibles en el suelo no enriquecido, como se reporta sobre las esporas de B. subtilis en suelo agrícola. Estos resultados son inusuales para Bt, que en lo general no germina en suelo, en contraste la GM-2, respondió a la concentración de dextrosa al 3 y 5% que estimularon la germinación de sus esporas como lo señala Pruett et al., (1980), Aranson et al., (1986) y Lambert y Perferoen (1992) al especificar que entre aislados de Bt existen diferencias en el patrón de utilización de azucares sencillos en función de su origen.

En el cuadro 3 se presenta que para lograr la germinación de las esporas de HD-1 fue necesario agregar además de dextrosa, extracto de levadura al 0.01%, ello supone que la supervivencia de las esporas de HD-1, y su rápida germinación en el suelo usado como control indica que la germinación de sus esporas no depende de carbono externo adicional externo, ello sugiere que HD-1 no comparte con GM1 y GM2 una respuesta fisiológica similar a la utilización de fuente de carbono simple contrario a la respuesta GM-1 que germinaron al adicionar dextrosa sólo al 5%, probablemente por una interacción de este azúcar con arcillas del suelo, pues concentraciones de 1 y 3% retardaron o inhibieron la germinación de sus esporas.

Estos resultados con las esporas de Bt sugiere diferencias en su exigencia de carbono y factor de crecimiento, lo cual apoya una aparentemente relación con su hábitat original de aislamiento, pues GM-1 y GM-2 se aislaron de suelo asimilaron nutrientes de este sitio como se observó en aquel usado como control absoluto, en donde nada se agregó. Mientras HD-1 aislada de insectos mostró mayor exigencia nutricional, está observación también la reporta Aronson et al., (1986). Lo que indica que entre los aislados de Bt podría establecerse una división basada en habitat de origen (suelo, agua, planta) en sus características bioquímicas y su relación con insectos.

Conclusión

Con base en la literatura revisada y los datos obtenidos en el presente trabajo se supone Bt sufrió una evolución a partir de una estrecha relación con los insectos, durante este proceso se dieron cambios genéticos que repercutieron en su comportamiento bioquímico que la independizaron de los insectos hasta convertirse en lo que es hoy, los resultados aquí obtenidos sostiene esta hipótesis.

Agradecimientos:

A la Dirección de Investigación Científica de la Universidad Autónoma de Nuevo León por el apoyo para la realización de esta investigación. A la CIC de la UMSNH por el proyecto 2.7 (2005-2006), por las facilidades para su publicación. A Beatriz Noriega por su trabajo de escritura.

LITERATURA CITADA

Aronson, A.I., Beckman W and Dunn, P. 1986. Bacillus thuringiensis and related insects pathogens. Microbiol. Rev. 50:1-24.

Roberts, R, and Granados, R. 1992. Biotechnology, Biopesticides and novel plant-pest resistance management. Boyce Thompson Institute for Plant Research, Ithaca, New York, pp: 88-100.

Dulmage, H.T. and Aizawa, K. 1982. Distribution of Bacillus thuringiensis in Nature. Microbial and Viral Pesticides. E. Kurstaki (ed.) M. Dekker. New York. pp: 209-236.

Lambert, B. and Perferoen, M. 1992. Insecticidal promise of Bacillus thuringiensis. Facts and mysteries about a successful biopesticide. BioScience 42:112-122.

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Ortiz, V.B. y Ortiz, C.A. 1980. Edafología. 3 ed. UACH. Chapingo. Edo. México. pp:123-130.

Luna Olvera H.A. y Peña-Cabriales, J.J. 1993. Ecología de Bacillus thuringiensis en "El bioinsecticida Bacillus thuringiensis. Ed. FCB-UANL. UNAM. México. pp: 35-75

García-Yáñez J., EC López-Barbosa y JM Sánchez-Yáñez. 2000. Biopesticida a base de Bacillus thuringiensis. Minirevisión. Cuatro Vientos:14:29-35.

Guillen R. D., López-Barbosa, EC., Farías-Rodríguez, R., Peña-Cabriales, J.J y Sánchez-Yáñez, JM. 2001. Granos de almacén un fuente de esporas de Bacillus thuringiensis. Ciencia Nicolaita. 28:179-192.

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Medrano G,MH., Luna O HA., Peña-Cabriales J.J y Sánchez-Yáñez, JM. 2000. Persistencia de celulas vegetativas de Bacillus thuringiensis en la rizosfera de frijol. TERRA 18:333-337.

Petras, S.F. and Casida, L.E. Jr. 1985. Survival of Bacillus thuringiensis spores in soil. Appl. Environ. Microbiol. 50:1496-1501.

Pruett, C.J.H., Burges, H.D and Wyborn, C.H. 1980. Effect of exposure to soil on potency and spore viability of Bacillus thuringiensis J. Invertebr. Pathol. 35:168-174.

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Sekjima Y., Akiba, Y., Ono, K., Aizawa, K and Fujiyoshi, N. 1977. Microbiol. ecological studies on Bacillus thuringiensis in soil of mulberry field Japan. J. Appl. Ent. Zool. 21:35-40.

West, A. W., Burges, H.D and Wyborn, C.H. 1985. Survival of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus spore inocula in soil: effect of pH, moisture, nutrient availability and indigenous microorganisms. Soil. Biochem. 17:657-665.

ANEXO

Cuadro 1. Efecto de la adición de diversos niveles de dextrosa sobre la germinación de esporas de de Bacillus thuringiensis GM-1 en suelo agrícola esterilizado.

Todas los valores son el promedio de 4 repeticiones, valores con letras iguales sin diferencia estadística significativa.

Cuadro 2. Efecto de la adición de dextrosa sobre la germinación de Bacillus. thuringiensis GM-2 en suelo agrícola esterilizado.

Todos los valores son el promedio de 4 repeticiones. Valores con letras iguales sin diferencia estadística significativa.

Cuadro 3. Efecto de la adición de dextrosa al 5% de amonio al 3% y sobre la germinación de esporas de Bacillus. thuringiensis HD-1 en suelo agrícola esterilizado y extracto de levadura (0.1%).

Todas los valores el promedio de 4 repeticiones. Valores con letras iguales sin diferencia estadística significativa.

1Delmas-Mata, J T

J M Sánchez-Yáñez2*

1Lab. de Microbiología Industrial y del Suelo. Fac, Ciencias Biológicas. Universidad Autónoma de Nuevo León, Apdo. Postal 414. San Nicolás de los Garza, Nuevo León México. 2Microbiología Ambiental. *autor correspondiente

Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Universidad Michoacana San Nicolás de Hidalgo,

Ed. B1, C.U. cp. 58030, Morelia, Michoacán, México