Parte 1
–pH salival: entre 7 y 8
–Tiempo de referencia: desapareció el color azul a los 5" 30"" de agregar la enzima a la dilución de 1/50 y se obtuvo un color pardo. Como este tiempo de referencia se obtuvo en el rango propuesto por el TP de entre 2 y 8 minutos, podemos afirmar que la dilución 1/50 es la óptima.
Parte 2
Dilución 1/100 NaCl con saliva: se observó una desaparición del color azul en el tubo 13 a los 6" 30"" de agregar la solución al tubo de almidón a 37° C. En el tubo control, luego de 17 tubos (pasados 8" 30""), no se apreciaron cambios (el color azul no desapareció), es decir, no hubo efecto acromático.
Esto quiere decir que en presencia de NaCl la actividad enzimática de la ααamilasa aumenta ya que necesita un tiempo menor al del control para lograr el efecto acromático. Se podría suponer que Na+ o Cl" o ambos pueden afectar la acción enzimática de ααamilasa.
Discusión:
Para empezar, se ha de aclarar que las diluciones óptimas para salivas de diferentes personas son distintas porque las características y concentraciones de los compuestos varían de una persona a otra. Esto mismo ocurre con el pH salival y el tiempo de referencia.
El rango de 2 a 8 minutos para el efecto acromático elegido se debe a que los tiempos sean manejables en el trabajo práctico. Si se buscase un tiempo de referencia muy pequeño, los cambios no hubiesen sido apreciados.
Por los experimentos que realizamos en el TP, no se puede conocer la forma en que el NaCl aumenta la actividad de la enzima, sin embargo, una vez finalizado el TP, nos informaron que recientes descubrimientos dieron a conocer que la a-amilasa contiene en los restos aminoacídicos de su sitio activo Cl–, y por ello, al agregar NaCl, los aniones cloruro se unen al sitio activo aumentando la actividad enzimática. Es decir, el cloro actúa como cofactor de la enzima.
La proteinasa K es una proteasa, es decir, tiene una actividad específica la cual consiste en degradar proteínas. La misma actúa rompiendo los enlaces débiles del polipéptido, hasta que adquiera su estructura primaria y, por lo tanto, pierda su funcionalidad.
La proteinasa K (100 µgl, disuelta en una solución acuosa con buffer) se incuba con la dilución de saliva (1 ml) durante 1h. a 50 grados Celsius (todo este proceso es el pre-tratamiento de la dilución). Luego de este lapso de tiempo se agrega la saliva tratada con proteinasa a los 10 ml de almidón y se repite el procedimiento para la determinación de la actividad enzimática realizado en la Parte 1.
Al ser la ααamilasa una proteína, uno esperaría que la proteinasa le haga perder su funcionalidad. Sin embargo, esto no ocurrió, puesto que luego de un determinado período de tiempo se observó el efecto acromático, es decir, la ααamilasaestaba actuando. Esto se puede explicar de diversas maneras. Por ejemplo, nunca averiguamos la concentración de la enzima en la saliva, por lo tanto, tal vez era muy superior a la de la proteinasa y por eso no llegó a cumplir se función. De la misma manera, hay que tener en cuenta el período de incubación. Tal vez no fue suficiente para que la proteinasa k degrade a la ααamilasa.
Por último, cabe aclarar que se efectuó un controlo de reacción para no concluir erróneamente. Se colocó en un tubo una dilución de saliva pero son sólo el buffer, para asegurarnos que no haya agentes externos que afecten los resultados.
En el pre-tratamiento de la enzima a una temperatura de 100 º C durante 10 minutos se trató previamente a la dilución optima de saliva 1/50 durante 7 minutos en un baño de agua a 100º C, pero al medir la actividad enzimática, con el mismo procedimiento descrito en la parte 1, no se observó ningún cambio del color azul, (por lo que se puede decir que no se produjo el efecto acromático), durante 7 minutos ( que es el tiempo de referencia obtenido por el grupo 2 con pH salival entre 7 y 8). A partir de los resultados obtenidos se podría deducir que la alfaa-amilasa se desnaturaliza al ser expuesta a una temperatura tan elevada, ya que se produce un exceso de choques entre las moléculas presentes en la saliva como consecuencia del aumento de la energía cinética, produciendo la ruptura de las uniones débiles (como puentes de hidrogeno, fuerzas de van der waals, interacciones iónicas), que afecta la estructura terciaria de la enzima y a su vez la conformación de su sitio activo, perdiendo la capacidad de romper las uniones C1-C4 de las glucosas. Y es por esto que el color azul no desaparece en los tubos de ensayo.
Con respecto a la influencia del pH del medio en la actividad enzimática de la a-amilasa, podemos decir que a pH extremos (es decir, muy ácidos o muy básicos) la enzima no funciona, o al menos disminuye notablemente su actividad. Esto podemos concluir a partir de los experimentos realizados por otros grupos, que, manteniendo el resto de las condiciones iniciales, midieron la actividad de la a-amilasa en dos medios con pH extremos.
El grupo 4 había encontrado un tiempo de referencia de 6 minutos (aparición del efecto acromático) para su dilución óptima y un pH salival de entre 6 y 7. Sin embargo, a un pH 2 (más ácido), no encontró cambios (es decir, no hubo efecto acromático) en 10 minutos de reacción. Algo parecido ocurrió con el grupo 12, que había encontrado un tiempo de referencia de 1" 30"" para un pH salival de entre 7 y 8, y cuando repitió el experimento en un medio con pH 12 (más básico) no hubo efecto acromático en 4 minutos de reacción.
Todas las enzimas tienen un pH óptimo, en donde tienen mayor actividad, y a medida que se alejan de ese pH (para ambos lados) disminuyen su actividad. Esto se debe a que algunos restos aminoacídicos de las enzimas (en el caso de que sean proteínas) tienen cargas y pueden ser los responsables tanto de mantener la estructura tridimensional de la proteína como de interaccionar con el sustrato. El pH del medio (es decir, la presencia de iones H+ u OH-) puede modificar las cargas de estos aminoácidos y de este modo incluso desnaturalizar a la enzima.
Debemos aclarar que aunque la enzima tenga actividad al pH salival de cada persona (siempre entre 6 y 8, según la tabla), esto no quiere decir que éste sea su pH óptimo. Para determinarlo experimentalmente, deberíamos haber medido la actividad enzimática a diferentes pH para realizar una curva, pero no podemos determinar el pH óptimo de la a-amilasa a partir de los resultados de este TP.
En el tratamiento del efecto de la temperatura, se mide la actividad enzimática como se efectuó en la parte 1, pero incubando la reacción a temperaturas diferentes de 37° C: a 0° C, a temperatura ambiente y a 70° C.
A 0° C y a 70° C, no se presentaron cambios de color en los tubos de la gradilla, es decir que el color azul nunca desapareció. Por lo tanto, se podría decir que la ααamilasa no actuó. En cambio, a temperatura ambiente sí se presentaron cambios, pero en un tiempo mayor al de referencia del grupo que lo realizó. Esto era de esperarse, ya que cada enzima tiene un rango de temperatura óptima y, en el caso de la ααamilasa, al encontrarse ésta en el cuerpo humano (que siempre tiene una temperatura de 37° C), se supone que a temperatura ambiente no va a perder su actividad, pero sí disminuirla, ya que los choques intermoleculares van a ser menores.
Sin embargo, al disminuir demasiado la temperatura, los choques entre las moléculas disminuyen también, por lo que la actividad enzimática baja hasta el punto en el que no se puede ver en el experimento. Por el contrario, al aumentar la temperatura de incubación a 70° C, los choques entre las moléculas se van a acrecentar de tal forma que la enzima se va a desnaturalizar. Es por ello que se presume que no se observaron cambios en los tubos.
Autor:
Agustín Garrido
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