Objetivos
- Aplicar las técnicas Inmunodifusión Doble de Ouchterlony e Inmunoelectroforesis, con el fin de estudiar la interacción Antígeno-Anticuerpo.
Materiales y Métodos
Inmunodifusión Doble de Ouchterlony
Se partió de placas de petri, las cuales contenían una capa de gel de agarosa 1% ya solidificado, y se le realizaron pocillos con una pipeta pasteur de vidrio; en estos posillos se realizo la siembra de las muestras.
Se sembró en el posillo del centro suero total de conejo anti-humano, y en los pocillos laterales:
1 suero humano 1/50
2 precipitado de sulfato de amonio 33% 1/20
3 precipitado de sulfato de amonio 50% 1/20
4 purificación por proteína A fracción 3 1/20
5 purificación por proteína A fracción 4 1/20
Análisis Inmunoelectroforetico
Los materiales utilizados en este ensayo fueron; un porta objetos, papel de filtro y agarosa.
Se colocaron sobre el portaobjetos dos tiritas de papel de filtro y se cubrió el porta objetos con una capa delgada de agarosa de forma tal que los papeles de filtro queden pegados y en forma de extensión, de esta forma se mantienen embebidos en el buffer de corrida; se le realizaron en la agarosa dos incisiones en forma de pocillo y una incisión central en forma longitudinal paralela al sentido de la corrida.
Luego se sembraron suero humano y precipitado por sulfato de amonio 33% en los pocillos y luego de la corrida, en la incisión central, se sembró suero total de conejo anti-humano; en todos los casos las siembras fueron realizadas con bromofenol como indicador de corrida.
Resultados
Inmunodifusión Doble de Ouchterlony
Nota: los resultados informados para esta técnica corresponden al grupo cuatro del turno mañana, debido a que el ensayo realizado por el grupo dos del turno mañana (Shalom F., Rapoport A., Melli L.) no se resolvió según lo esperado.
Figura 2: Placa de inmunodifusión correspondiente al grupo 4 del turno mañana.
A Suero de conejo total anti-humano, 1 Precipitado sulfato de amonio 50% ½, 2 Precipitado sulfato de amonio 50%, 1/10 3 Precipitado sulfato de amonio 50%, 1/20 4 Precipitado sulfato de amonio 50%, 1/50 5 Precipitado sulfato de amonio 50%, 1/100.
B IgGs de conejo 1 Suero humano 1/50 2 Proteina A (fracc. 4) 1/5 3 Suero humano 1/100 4 Proteina A (fracc. 4) 1/50.
En la Figura 2 se pueden observar los resultados de la inmunodifusión. Se pueden visualizar las bandas de precipitación en azul (encerradas en la circunferencia roja)
En todos los casos se visualiza un patrón de identidad total, debido a que en los pocillos se encuentra el mismo antígeno en distintas concentraciones.
Existe una relación entre la concentración del antígeno sembrado y la posición de la banda. Cuanto mas concentrado se encuentre el antígeno mas lejos del posillo se encontrara la banda.
Es por esto que la banda correspondiente a sulfato de amonio 50% (1/2) se encuentra mas cerca del pocillo central (pocillo de siembra de suero de conejo total anti-humano) que las demás bandas.
En el caso de B (IgGs de conejo) no se pueden interpretar muy bien los resultados debido a que la banda es muy tenue.
Análisis Inmunoelectroforetico
En la Figura 3 se puede observar de forma esquemática el patrón de migración de las γ,α y β globulinas, asν como también la Albúmina (Alb).
Figura 3: Patrón de migración
En la Figura 4 se pueden observar los resultados correspondientes a la inmunoelecroforesis. Para los grupos 1, 2 y 3 que sembraron suero de conejo total anti-humano, se pueden observar los cuatro tipos de globulinas en orden (como se denota en la Figura 3). En el caso del grupo 4 que sembró anti-IgG de conejo, solo se pueden observar las gamma globulinas.
Grupo 1:
Suero de humano total (izquierda): se observa el patrón de globulinas como se denota en la Figura 3 (gamma, beta, alfa y albúmina).
Fracción 4 de proteína A (derecha): se observan solo las gamma globulinas.
Grupo 2:
Suero de humano total (izquierda): se observa el patrón de globulinas como se denota en la Figura 3 (gamma, beta, alfa y albúmina).
Precipitado sulfato de amonio 33% (derecha): idem que para suero humano total.
Grupo 3:
Suero de humano total (izquierda): se observa el patrón de globulinas como se denota en la Figura 3 (gamma, beta, alfa y albúmina).
Precipitado sulfato de amonio 50% (derecha): se observan solo dos bandas
Figura 4: Placas de Inmunoelectroforesis; turno tarde se denota con T y turno mañana M.
Conclusiones
Se pudieron realizar las técnicas de Inmunodifusión radial e Inmunoelectroforésis para estudiar la interacción Antígeno-Anticuerpo, así como también el marco teórico de las mismas.
Con respecto a la Inmunodifusión, se pudieron observar patrones de identidad total en los resultados según lo esperado. Sin embargo no se pudieron analizar los resulados de la siembra con IgGs de conejo (B), debido a que las bandas resultaron muy tenues.
Los resultados de la Inmunoelectroforesis nos permitieron observar el patron de migracion de las distintas globulinas.
Rapoport, Ayelen
Shalóm Fabián
Melli, Luciano J.
Laboratorio de Inmunología Molecular – Instituto de Investigaciones Biotecnológicas – UNSAM
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