Proteinas en gel de poliacrilamida

Obtención de un homogenato y determinación de la concentración de proteínas del mismo. Electroforesis de proteínas en gel de Poliacrilamida.

Resumen

Para que un proceso sea exitoso es crítico obtener el máximo de pureza con la mínima pérdida de material. El primer paso en la purificación es la ruptura de tejidos o células microbianas a través de un homogeneizador manual para liberar sus proteínas en una solución llamada extracto crudo u homogenato.

Procedimiento para la obtención del homogenato

Procesamos muestras de hígado de ratón obtenidas en dos buffer:

-Buffer TE (Tris-HCl 60 mM –EDTA 1 Mm Ph 6,8): 200 ml

-Buffer de lisis (Tris-HCl 20 mM pH 8 NaCl 137 Mm, NP-40 al 1% (al tener éste detergente, la extracción es más efectiva, ya que solubiliza los lípidos de membrana) y glicerol 10% (para que las proteínas no se desplacen por los pocillos): 200 ml

Tomamos muestras de hígado de ratón lo colocamos en un tubo, agregamos buffer (éste ayuda a romper la muestra y brinda las condiciones necesarias para poder extraerlas), llevamos el tubo a un baño de hielo para proteger a las proteínas de las desnaturalización y mantener la temperatura de la solución baja. Por medio de un homogenizador de mano (trabajo mecánico, produce un aumento de la temperatura) se procede a la homogenización de la muestra hasta la desaparición de los restos visibles de tejido. Las muestras se centrifugan por 10 min. a 10000 rpm a 4ºc para separar lo soluble de lo precipitado. Obteniéndose el pellet (insolubles, son descartados) y sobrenadante (todas las proteínas solubles, lo que denominamos homogenatos)

Luego el homogenato es separado mediante pipeta Pasteur y conservados.

Determinación de la concentración de proteínas del homogéneo por el método de Bradford

Utilizamos una mezcla de proteína (50 ul) y un reactivo de Bradford (2,5ul) que contiene un colorante Coomasie blue, se forma un complejo proteína-colorante que absorbe a Abs 595nm.

El método de Bradford se basa en la unión del colorante Coomassie blue G-250 a la proteína produce un corrimiento del máximo de absorbancia de 465nm (forma roja del colorante libre) a 595 nm (forma azul del complejo colorante-proteína).Se empleara este método indirecto para determinar la concentración de proteína de los homogenatos. El método de bradford es un método indirecto porque no mide la concentración de proteína sino mide la absorbancia y en base a eso se obtiene la concentración. No usamos un método directo ya que trabajamos sobre una mezcla de proteínas, por lo cual no se puede determinar el coeficiente de extinción (?), ya que cada proteína posee un épsilon distinto.

La concentración de proteína de la muestra se determinara interpolando en una curva de calibración.

La curva de calibración se realiza con Albumina bovina (BSA) como proteína patrón. Las concentraciones de BSA se obtienen por diluciones seriadas de un stock madre de proteína de 1mg/ml. A cada concentración de albúmina la hago reaccionar en igual proporción con el reactivo de Bradford.

Agitamos en vórtex y leemos la absorbacia a 595 nm a los 10 minutos. Realizamos las determinaciones por triplicado.

CURVA DE CALIBRACION DE LA BSA

Hacemos un promedio entre los valores de Abs obtenidos para cada concentración , para obtener un valor más preciso y grafico los datos en una curva de calibración.

* Abs del reactivo de Bradfort solo, como blanco:

* Abs de la muestra obtenida al comienzo del práctico (homogenato que conservamos) + el buffer TE:

*Abs de la muetra + buffer de lisis:

Electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida

EN LA ELECTROFORESIS, LAS PROTEINAS SE MOVILIZAN A TRAVÉS DE UNA MATRIZ SÓLIDA, ES MÁS UILIZADO ES LA POLIACRILAMIDA.ÉSTE SOPORTE ES UN POLÍMERO FORMADO CON ACRILAMIDA Y UN AGENTE DE ENTECRUZAMIENTO, LA BIS-ACRILAMIDA.LAS PROTEÍNAS SON SOMETIDAS A UN CAMPO ELÉCTRICO, LAS DE MAYOR TAMAÑO SERÁN MÁS RETENIDAS QUE AQUELLAS DE MENOR PESO MOLECULAR.

SE REALIZA UNA ELECTROFORESIS EN GEL DE POLICRILAMIDA EN PRESENCIA DE SDS (SDS-PAGE),ES UNA ELECTROFORESIS DESNATURALIZANTE. AL GEL SE LE AGREGA UN DETERGENTE ANIONICO, EL CUÁL SE UNE A LAS PROTEÍNAS ROMPIENDO LOS ENLACES NO COVALENTES PROVOCANDO SU DESNATURALIZACIÓN. EN PRESENCIA DE SDS LAS PROTEINAS ADQUIEREN LAS MISMA RELACIÓN Q/M Y MIGRAN EN EL CAMPO ELÉCTRICO SOLO POR DIFERENCIA DE SU PESO MOLECULAR.

PREPARACION DE GELES:

VOLUMEN FINAL 10 ML 10 ML

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA:

A PARTIR DE LOS HOMOGENATOS DE TEJIDOS HEPÁTICO DE RATA Y BUFFER DE MUESTRA 5X (4VOL DE MUETRA +1VOL DE BUFFER DE MUESTRA).

SEMBRAMOS LAS MUESTRAS CON PIPETA AUTOMÁTICA.

REVELADO:

UNA VEZ FINALIZADA LA ELECTROFORESIS, SE COLOCA EL GEL EN LA SC COLORANTE (AZUL DE COOMASSIE), LUEGO SE PASA A UNA SC FIJADORA Y POR ÚLTIMO SE DECOLORA EN REPETIDOS BAÑOS EN SC DECOLORADORA.

EN EL GEL SE DISTINGUEN, LA ZONA DE STACKING PH: 6,8 (ÁCIDO),ÉSTE TIENE MENOR %DE ACRILAMIDA, SIRVE PARA QUE TODAS LAS PROTEÍNAS PARTAN DE UN MISMO LUGAR DE CORRIDA. SIRVE DE APILAMIENTO DE LAS MISMAS.

UNA VEZ QUE LA MUESTRA SEMBRADA PASA LA ZONA DELIMITADA ENTRE STACKING Y LA ZONA DE RESOLUCIÓN, EL PH AUMENTA A 8 (BÁSICO).EN LA ZONA DE RESOLUCIÓN LAS PROTEÍNAS COMIENZAN A SEPARARSE POR DIFERENCIA DE TAMAÑO, YA QUE LA RELACIÓN CARGA SE MANTIENE CTE.

La distancia de migración de la banda incógnita es de 3,6cm, la cual se interpolo para obtener:

Log PM = 2 ? log-1 = 100 KDa ? peso molécular de la proteína

Autor:

Polverini Elisabth, Irusta Mariana