Aislamiento Si estamos buscando agliconas en el material vegetal, podemos realizar un lavado con solventes no polares como el caso de cloruro de Metileno, éter di etílico, acetato de etilo. (aunque se encuentra raramente bajo la forma de agliconas) Normalmente la extracción podemos realizarla bajo un equipo soxhlet a 60 C durante 2 horas y comprobar la presencia de Agliconas en dicho extracto. Luego podemos proceder a realizar una extracción con mezclas de MeOH: H2O, la eficiencia de la extracción puede mejorar con sonificacion del material vegetal
Aislamiento Los flavonoides en el material vegetal se encuentran siempre conjugados con o-glic o c-glic, raramente se encuentra bajo la forma de aglicona. Para casos practico de aislamiento sera necesario separar estos glucósidos del esqueleto de los flavonoides, para esto se propone una hidrolizar acida.
Aislamiento Sistemas Cromatográficos para la extracción: existen varios sistemas para la extracción de las Isoflavonas mediante columnas Cromatográficas. Fases estacionarias: Poliamida, Sephadex LH20, C18 RP Fases Móviles: Migración y mixturas de compuestos Polares a Hidrófobicos
Solventes de desarrollo Serie eluotropa El poder eluyente aumenta con la Polaridad del disolvente -Hexano -Tetracloruro de carbono -Benceno -Diclorometano -Cloroformo -Eter dietilico -Acetato de etilo -Acetona -Isopropanol -Etanol -Metanol –Agua Aumenta el poder eluyente Polaridad creciente
Caracterización Son moléculas difíciles de caracterizar, normalmente se determinan bajo el brillo en presencia de fluorescencia, de color azul intenso, que cambia a Marrón intenso en presencia de vapores de amoniaco.
Características espectrales de las Isoflavonas
Espectroscopia UV La banda II de absorción de las Isoflavonas normalmente ocurre en la región de 245-270 nm y generalmente no es afectada por el incremento de la Hidroxilacion del anillo B, pero si es desplazada bato crómicamente por Hidroxilacion del anillo A
Características de las espectroscópicas: Isoflavonas Polioxigenadas, que tengan la banda II de absorción, entre 265 y 270 generalmente son trioxigenadas en el anillo A. La metilación o Glicosilacion de 7 o 4’-OH tiene un pequeño o muy pequeño efecto sobre el espectro UV, Mientras que una sustitución en el 5-OH causa un ligero desplazamiento Hipsocromico.
Espectroscopia uv Reactivos de Desplazamiento
Técnicas Espectrométricas Los tipos de análisis mas importantes para el trabajo con flavonoides, son los relacionados con la Espectrometría de MS, MS/MS y la RMN 1H y RMN 13C. El trabajo con IR no ayuda en gran manera, debido a la cantidad de señales iguales, que se solaparían.
Es una técnica instrumental sofisticada que separa y detecta iones en fase gaseosa. Se basa en ionizar moléculas gaseosas convirtiéndolas en iones (generalmente cationes), que se separan al ser acelerados por un analizador de masa: la separación se basa en la distinta relación m/z de los iones. Espectrometría de masas
ESPECTRÓMETRO DE MASAS Componentes del instrumento Introducción de la muestra Fuente de ionización Separador de masas Detector iónico Procesador de señal Registrador El acoplamiento entre CG y HPLC con EM se analizará más adelante
Ionización por impacto electrónico Ionización química Fuente de bombardeo con átomos rápidos Desorción con láser Ionización a presión atmosférica: – Electronebulización asistida con un gas: electrospray – Ionización química a presión atmosférica – Fotoionización a presión atmosférica Fuentes de ionización HPLC
Ionización por impacto electrónico placa de repulsión placas focalizadoras haz de electrones (70 eV) moléculas neutras moléculas neutras placas aceleradoras (4000 V)
(Gp:) filamento de W
(Gp:) iones
(Gp:) M + e M.+ + 2e
ion molecular
Fragmentación del ion molecular Molécula hipotética ABCD (A, B, C y D = átomos) Fragmentación del ion molecular ABCD.+ + ABCD (ABCD)2.+ BCD. + ABCDA+ Colisión seguida de fragmentación (Gp:) ABCD.+ ADBC.+ (Gp:) BC. + AD+ AD. + BC+
Reordenamiento seguido de fragmentación (Gp:) ABCD + e ABCD.+ + 2 e ABCD.+ A+ + BCD. A. + BCD+ BC+ + D CD. + AB+ AB. + CD+ (Gp:) B + A+ A + B+ (Gp:) D + C+ C + D+
Ionización química (Gp:) CH4+ + CH4 CH5+ + CH3 CH3+ + CH4 C2H5+ + H2
(Gp:) CH5+ + MH MH2+ + CH4 C2H5+ + MH M+ + C2H6
(Gp:) CH4 + e (alta energía) CH4+ y CH3+
(Gp:) Gas reactivo metano, isobutano, amoníaco (cámara de ionización de “alta” presión a 10 torr)
Transferencia protónica entre molécula reactiva y analito
Espectrómetro de masas de sector magnético Espectrómetro de masas de cuadrupolo Espectrómetro de masas de tiempo de vuelo Espectrómetro de masas de trampa iónica Separador de masas
Espectrómetro de masas de sector magnético
¿cómo se separan los iones de distinta masa? m : masa v : velocidad de la partícula m : masa z : carga V : diferencia de potencial (Gp:) FM = Bzv FC = mv2/r (Gp:) mv2/r = Bzv v = Bzr/m
FM : fuerza centrípeta FC : fuerza centrífuga B : campo magnético r : radio de curvatura Bzr/m = (2zV/m)½ m/z = B2r2/2V (Gp:) Ecinética = ½ mv2 = zV v = (2zV/m)½
Espectrómetro de masas de cuadrupolo (Gp:) Ø = 6 mm
Espectrómetro de masas de cuadrupolo
(Gp:) Potencial corriente directa (Gp:) tiempo (Gp:) masa (Gp:) Potencial de radiofrecuencia
Relación de voltajes durante un barrido de masa con un analizador cuadrupolo
EM de tiempo de vuelo (TOF: time of flight) pulsos de 300 V, 3.000-20.000 veces/s
Espectrómetro de masas de trampa iónica electrodo anular central tapa tapa Vrf
Esquema detector de trampa iónica (ITP)
Espectros de masas Energía de ionización de la molécula Grupos funcionales de la molécula Método de ionización Presión y temperatura de trabajo Diseño instrumental Dependen de:
Espectros de masas obtenidos por impacto electrónico En este ejemplo el pico base se forma por pérdida de CH3 (Gp:) Etilbenceno
(Gp:) pico base
ion molecular (ion “parent”) M+ ? fragmento de mayor masa molécula con número par de N ? M+ con masa par molécula con número impar de N? M+ con masa impar 4 H ? M-4 F ? M-19 CH3? M-15 HF ? M-20 NH3 ? M-17 C2H2 ? M-26 H2O ? M-18 Átomos y grupos frecuentemente desplazados
| Página siguiente |