Perspectiva para la fabricación de un Bionematicida a partir del hongo Pochonia chalmydosporia

1. Resumen
3. El Control Biológico dentro de una agricultura sostenible
4. El control biológico de nematodos formadores de agallas del género Meloidogyne
5. Pochonia chlamydosporia como agente de control biológico de nemátodos
6. Limitaciones en el desarrollo de bioplaguicidas a partir de hongos
7. Los sistemas de gestión de la calidad y la producción
8. Bibliografía

Resumen

La agricultura actual demanda la reducción de plaguicidas químicos y la introducción de sistemas sustentables con el uso de agentes de control biológico. La cepa Vcc-108 de Pochonia chlamydosporia var. catenulata se reconoce como un potencial agente de control biológico de nematodos formadores de agallas, reduciendo la infestación de Meloidogyne incognita en sistemas de producción comercial en Cuba. Una necesidad de la producción de bioplaguicidas microbianos es contar con estudios de caracterización, estabilidad, efectividad in vitro y en campo, estudios toxicológicos, método de producción y un efectivo sistema de calidad que garantice productos seguros y eficaces, de lo cual adolecen muchos sistemas de producción de bajos insumos alrededor del mundo y que deteriora la imagen de estos productos. Se presentan los resultados fundamentales que evidencian las perspectiva para la fabricación de un Bionematicida a partir del hongo Pochonia chalmydosporia Se aportan metodologías, referencias y conceptos que pueden ser utilizadas por los productores de este tipo de industria, para la fabricación de bioplaguicidas seguros y eficaces.

Palabras claves: Bionematicida, Pochonia chalmydosporia, producción de bioplaguicidas microbianos.

Introducción

Uno de los problemas fitosanitarios en el mundo y en Cuba, es la alta incidencia de nemátodos formadores de agallas, especialmente Meloidogyne incognita (Kofoid y White) Chitwood, que provoca serias afectaciones en los rendimientos y la calidad de la cosecha de cultivos de importancia económica (Castillo, 1988; Stefanova y Fernández, 1995). En este contexto, el desarrollo y aplicación de Agentes de Control Biológico (ACBs) adquiere una importancia relevante como una alternativa ambientalmente segura para el manejo de plagas en los programas de producción diversificada de alimentos y la reducción de plaguicidas químicos.

El control biológico de nematodos formadores de agallas abarca una gran diversidad de organismos que viven en el suelo, informados como enemigos naturales de los nematodos que atacan a las plantas. Entre ellos se destacan la bacteria Pasteuria penetrans (Thorne) Sayre y Starr sensu stricto Starr y Sayre y los hongos Arthhobotrys irregularis (Matr.) Mekhtieva, Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson y Pochonia chlamydosporia (Goddard) Zare y W. Gams, siendo estos dos últimos los más promisorios en el control de esta plaga (Whitehead, 1997; Kerry, 2001).

En Cuba, Hidalgo y col., (2000), evaluaron aislamientos autóctonos de P. chlamydosporia y seleccionaron a la cepa Vcc-108 de P. chlamydosporia var. catenulata (Kamyscho ex Barron y Onions) Zare y W. Gams como potencial ACB de Meloidogyne spp., proponiendo un método de producción masiva mediante formulación sólida en bandeja, sentando las bases para el desarrollo de productos eficaces y comercialmente viables.

Atendiendo a las potencialidades de este hongo para el control de nematodos formadores de agalla, se han precisado como principales direcciones de trabajo la obtención de una formulación comercial y la propuesta fundamentada de una estrategia de manejo, con la aplicación de cepas seleccionadas en combinación con cultivos menos susceptibles o resistentes a los nemátodos y que soporten un crecimiento extensivo del hongo en su rizosfera (Kerry y Bourne, 1996; Atkins y col., 2002; Kerry e Hidalgo, 2004).

El proceso de obtención y comercialización de plaguicidas microbianos ha estado limitado por diferentes causas, informándose problemas con la consistencia de las tecnologías productivas y de productos con mala calidad, fundamentalmente en países del Tercer Mundo (Jenkins y Grzywacz, 2000), y por tanto la poca competencia en el mercado de estos productos microbianos (Whipps y Lumsden, 2001). Esta situación debe ser revertida a partir de un estudio profundo de cada elemento que interviene en la fabricación y demostrada para cada ACB microbiano.

En el desarrollo de otras industrias, estos problemas se han solucionados con la implantación de Sistemas de Gestión de la Calidad, y en el caso específico de las industrias reguladas, como la farmacéutica, con la implementación de Buenas Prácticas de Fabricación (BPF), constituyendo la vía para la obtención de productos seguros y eficaces, principios que también caracterizan a los productos bioplaguicidas de origen microbiano. Sin embargo, en la fabricación de estos productos estas experiencias son muy limitadas y no se señala la existencia de Guías de Buenas Prácticas de Fabricación.

La práctica de establecer documentos de BPF existe desde la década del 60 del Siglo XX en la industria farmacéutica (OMS, 2003) y se ha convertido en un método de amplio uso por todos los países del mundo para las industrias reguladas, como la de alimentos. La elaboración y aprobación de estos documentos se ha extendido, de manera que constantemente se renuevan y se ajustan dependiendo de los intereses de los productores y reguladores. En la industria de los bioplaguicidas, aunque en determinados casos se ha trabajado fuertemente y se han establecido principios de aseguramiento de la calidad, como es en la cría de insectos como controles biológicos (Leppla y col., 2002), no se ha explotado ampliamente los conceptos de las BPF y esto se ha hecho más deficitario en el caso de los bioplaguicidas microbianos, lo cuales tienen su propia especificidad.

Cuba, al igual que otros países, cuenta con pocas regulaciones para esta industria y solo recientemente se ha establecido el registro de estos productos. En los Centros para la Reproducción de Entomófagos y Entomopatógenos (CREE) del país, se han estado dando algunos pasos importantes para lograr un incremento de la productividad y calidad de sus producciones; identificando dentro de estas investigaciones el desarrollo de sistemas de control de la calidad más exigentes (Fernández-Larrea, 2001), sin embargo, aún no cuentan con un documento de BPF que les ayudaría en este objetivo y permitiría una organización apropiada y un lenguaje común para estos procesos.

Los documentos de BPF deben diseñarse con los requisitos mínimos necesarios para lograr de manera sistemática productos de calidad. Por esta razón, para definir estos documentos guías, primeramente se debe identificar cuales son los aspectos propios de las producciones de bioplaguicidas microbianos que resultan vitales para asegurar estos resultados.

El ACB transita por varias fases para la obtención de un producto que pueda ser aplicado y comercializado, en estas fases se desarrollan los resultados que a continuación presentamos y que demuestran las perspectivas con este hongo en la fabricación de un Bionematicida.

Desarrollo

1. El Control Biológico dentro de una agricultura sostenible

Las Naciones Unidas estiman que 2, 000 millones de personas en el mundo están afectadas por enfermedades ocasionadas por la desnutrición y el uso de sustancias nocivas a la salud (FAO, 1995). Crear las condiciones para la producción de alimentos seguros y el desarrollo de una agricultura sostenible es una prioridad para los gobiernos e instituciones internacionales, para lo que se requieren cambios políticos y económicos (Dinham, 1996). La definición de agricultura sostenible comprende la dirección y conservación de los recursos naturales y la orientación de cambios tecnológicos e institucionales de manera que aseguren el logro y la satisfacción continuada de las necesidades humanas para las generaciones presentes y futuras. Este desarrollo sustentable en la agricultura, silvicultura y sectores de las pesquerías, la tierra, el agua, recursos genéticos de plantas y animales, debe estar basado en técnicas medioambientalmente no degradantes, económicamente viables y socialmente aceptables (FAO, 1988).

La Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA) define un Plaguicida como, cualquier sustancia o mezcla de sustancias para prevenir, destruir, repeler o mitigar cualquier plaga. Esta definición es bastante amplia, pero tiene algunas exclusiones como son, las drogas usadas para el control de enfermedades humanas o animales reguladas por la Agencia de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA); fertilizantes, nutrientes y otras sustancias usadas para promover la sobrevivencia y salud de las plantas; productos que contienen ciertos ingredientes de bajo riesgo, como aceites de menta y ajo y los ACB, (EPA, 2001). Entendiéndose como ACB a un enemigo natural, antagonista o competidor u otra entidad biótica capaz de reproducirse, utilizados para el control de plagas (FAO, 1999).

El control biológico de plagas a través de la acción de los ACB, contempla el fortalecimiento del control natural, la introducción de especies no nativas y el uso de plaguicidas derivados de animales, plantas, hongos, bacterias, virus y minerales para prevenir, repeler, eliminar o bien reducir el daño causado por las plagas (Carballo y Guaharay, 2004).

La segunda edición del Manual de Bioplaguicida, estableció cinco grupos de ACB y dentro de ellos señala a los Microorganismos (virus, bacterias, hongos, protozoos y nemátodos), como importantes en el manejo integrado de cultivos y agricultura orgánica como estrategias convencionales en la protección de los cultivos (Cooping, 2001).

Actualmente estos productos representan apenas el 2% del mercado mundial de plaguicidas. En los Estados Unidos a finales del 2001 fueron registrados aproximadamente 195 ingredientes activos y 780 productos clasificados como bioplaguicidas, estimándose cerca de 72 bacterias, 47 hongos, 40 nemátodos y 2 protozoos (EPA, 2002).

De forma general el desarrollo de estos productos transita por varias fases que comienza con el aislamiento del ACB del ambiente; estudios ecológicos, fisiológicos y taxonómicos; demostrar efectividad por bioensayos de laboratorios y campo; establecimiento del proceso de producción masiva de un inoculo estable y sus costos; formulación y efectividad en campo; estrategia de aplicación; comercialización y por último el programa de manejo integrado donde va a ser utilizado (IBCD, 2001).

En Cuba, desde la década del 70 se producen y aplican diversos bioplaguicidas microbianos, que actualmente permiten cubrir más de medio millón de hectáreas anuales en diferentes cultivos y contra varios grupos de plagas (Fernández-Larrea, 2001).

Como una vía de diversificación, descentralización y producción ecológicamente factible, en nuestro país se han venido utilizando en los últimos años nuevas formas de tenencia de la tierra y producción, entre ellas la producción en organopónicos y huertos intensivos comunitarios (Casanova, 1995) (Figura 1). En ellos se desarrollan programas de producción de alimentos como: Programa de Agricultura Urbana (hortalizas, arroz, viandas y proteína de origen animal), y Programa de Agricultura Orgánica (vegetales, miel de abejas, azúcar de caña, cacao, café, cítricos), entre otros (Hidalgo y col., 2002). En estos últimos años las hortalizas frescas y de alta calidad han tenido una demanda creciente por la población y el turismo.

Figura 1. Huerto intensivo de la comunidad de Alamar. Ciudad de la Habana. Cuba.

La inmensa mayoría de los cultivos hortícolas son buenos hospedantes de nematodos del género Meloidogyne, especialmente M. incognita, por lo que éstos constituyen una de las más serias amenazas para los sistemas de producción intensiva de hortalizas (Stefanova y Fernández, 1995). De igual manera ocurre con otros cultivos de importancia económica (Noe y Sikora, 1990), donde se informan pérdidas de alrededor del 10% de la producción agrícola mundial (Whitehead, 1997) y causan 80 mil millones de USD de pérdidas en los cultivos cada año (Handoo, 2001).

1.2 El control biológico de nematodos formadores de agallas del género Meloidogyne

Los nematodos se clasifican en fitonematodos, zoonematodos, nematodos entomopatógenos y nematodos de vida libre (Stirling, 1991).

El control de fitonematodos se define como tácticas específicas dirigidas a reducir o eliminar poblaciones de nematodos, reservando el término manejo de nematodos a los esfuerzos empleados para reducir el número de nematodos por debajo del umbral de daño mediante el uso de múltiples procedimientos de control (Thomason, 1987).

Bridge (1996), propone cuatro estrategias para el manejo de fitonematodos basado en el uso no directo de químicos, métodos culturales y físicos, uso del control biológico y mantenimiento de la biodiversidad de los múltiples cultivos y cultivares que incrementan la resistencia o tolerancia de los nematodos. Este mismo autor reconoce que a pesar de todos los estudios relacionados con este tema, aún no se tienen todas las respuestas para el control, en la práctica, de los fitonematodos en sistemas agrícolas sustentables.

El control biológico de nematodos formadores de agallas abarca una gran diversidad de organismos que viven en el suelo, que incluyen virus, rickettsias, bacterias, hongos nematófagos, protozoos y tardígrados, también depredadores como turbelarios, nematodos, enchitridos, ácaros, collembolos y otros insectos (Kerry, 1995).

Dentro de ellos, las bacterias y los hongos muestran las mayores potencialidades como ACB. Entre las bacterias se destaca P. penetrans (Whitehead, 1997). En Cuba, recientemente se ha informado a las cepas LBT-3 y C-924 de Bacillus thuringiensis Berliner y Tsukamurella paurometabolum (Steinhaus) Collins, Smida, Dorsch y Stackebrandt, respectivamente, con posibilidades de ser empleadas como eficaces bioplaguicidas (Mena, 2004). Entre los hongos encontramos a A. irregularis, P. lilacinus y P. chlamydosporia, siendo estos dos últimos los más eficaces en el control de esta plaga (Kerry, 2001).

1.3 Pochonia chlamydosporia como agente de control biológico de nemátodos

Uno de los hongos nematófagos más estudiados es P. chlamydosporia, considerado como uno de los agentes de control biológico más promisorios para el manejo de poblaciones de nemátodos formadores de agallas (Kerry y Jaffee, 1997), en particular de huevos de M. incognita (Kerry, 1987; Bourne, 1995; Hidalgo, 2000).

Los trabajos actuales con este agente están dirigidos al aislamiento y selección de cepas nativas y la obtención de formulaciones comerciales (Hidalgo et al. 2004, Rivero y Campos, 1993; Ciancio y Leonetti, 1999). También se propone estudiar estrategias de manejo de poblaciones de nemátodos agalleros con la combinación de la aplicación de las cepas seleccionadas y cultivos menos susceptibles o resistentes a los nemátodos, que soporten un crecimiento extensivo del hongo en su rizosfera (Kerry y Bourne, 1996; Bourne y Kerry, 1999; Atkins y col., 2002, Kerry e Hidalgo, 2004).

Para hacer realidad la viabilidad productiva de este hongo como agente de control biológico, es necesario trabajar en la búsqueda de métodos que permitan la producción de un gran número de clamidosporas, estructura que facilita al hongo establecerse en el suelo y sobrevivir cuando el número de nemátodos es escaso. Otras fases del hongo no pueden competir con la microflora del suelo y por consiguiente requieren de suplementos nutritivos (Kerry y col., 1993).

Este hongo crece fácilmente en un rango amplio de cultivos, in vitro, pero no produce clamidosporas en fermentaciones líquidas sumergidas (Kerry y col., 1986). La producción de clamidosporas es posible en medios sólidos, pero sus rendimientos son bajos para una explotación comercial (Montes de Oca, 2004, Kerry y Bourne, 1996).

Diferentes proyectos de investigación se desarrollan para viabilizar este empeño, pero aún en la práctica agrícola no se utilizan productos a partir de este hongo.

1.3.1 Descripción de Pochonia chlamydosporia

P. chlamydosporia (ex Verticillium chlamydosporium Goddard) es un Deuteromycete, parásito facultativo de huevos de nemátodos de quistes y agallas ampliamente distribuido en el mundo. Aparece como parte de un complejo de diferentes especies estrechamente relacionadas (Zare y col., 2000).

La identificación de esta especie comienza en 1913, cuando Goddard aisló de suelo de jardín a un hongo que identificó como V. chlamydosporium. Hace cerca de tres décadas, Gams (1971) redescribió el género Verticillium y propuso una nueva sección, Prostrata, para incluir aquellos hongos sin conidióforos erectos bien definidos. Esta sección abarcó, fundamentalmente, a patógenos de invertebrados originalmente ubicados en el género Cephalosporium. Balazy (1973) no estuvo de acuerdo y conservó las especies con fiálides verticiladas en Cephalosporium. Esta clasificación no ha sido generalmente aceptada (Carmichael y col. 1980) y subsecuentemente, Gams y van Zaayen (1982) propusieron dos nuevas secciones, Nigrescentia y Albo-erecta, acomodando a las especies patógenas de plantas y fungícolas, respectivamente.

La controversia sobre la ubicación taxonómica de este género, es el resultado de la imposibilidad de reconocer la diversidad genética dentro de este grupo (Rowe, 1995). Por tal motivo, Gams y colaboradores desarrollaron una serie de estudios morfológicos y moleculares clasificando las especies de este género en cuatro grandes grupos (A, B, C y D) teniendo en cuenta el rango de hospedante, ubicando en el grupo D a los hongos parásitos de huevos de nemátodos y quistes, típicos en producción de dictioclamidosporas (Zare y col., 2000; Zare y col., 2001).

Posteriormente, Sung y col., (2001) realizaron estudios sobre las secuencias nucleotídicas de pequeñas y grandes subunidades nucleares del ADN ribosomal (ADNr) de especies representativas del género Verticillium considerados dentro del grupo D y definieron tres linajes, incluyendo al hongo nematófago V. chlamydosporium en el D2, estableciendo que la mayoría de las especies de Verticillium sec. Prostrata son miembros de la familia Clavicipitaceae. Finalmente, las observaciones y análisis filogenéticos de las pequeñas y grandes subunidades del ADNr, 5.8S y la región ITS (Internal Transcribed Spacer) permitieron reubicar a las especies de hongos parásitos de huevos y quistes de nemátodos y que forman clamidosporas (V. chlamydosporium) en el género Pochonia (Gams y Zare, 2001).

Para este género y las especies incluidas estos autores informan las siguientes características:

Colonias de rápido crecimiento con 15-40 mm de diámetro de la colonia en 10 días. Conidióforos usualmente postrados y pequeñas hifas diferenciadas, algunas veces erectas. Fiálides verticiladas o solitarias. Conidios de forma subglobosa, elipsoidal a bacilar. Producen dictioclamidosporas sobre la superficie de la colonia o en el agar sumergido. Cristales ausentes.

Para la especie se han informado los siguientes sinónimos:

Verticillium chlamydosporium (Goddard, 1913)

Stemphyliosis ovorum (Petch, 1939)

Diheterospora heterospora (Kamyschko, 1962)

Pochonia humicola (Batista y Fonseca, 1965)

Dictyoarthrinopsis kelleyi (Dominik y Majchrowicz, 1966)

Diheterospora chlamydosporia (Barron y Onions, 1966)

Otro aspecto que ha resultado controversial en esta especie, es la definición de las taxas chlamydosporia y catenulata, como especies separadas o como variedades de una misma especie. Debido a que la principal diferencia entre ellas lo constituye la disposición de los conidios en las fialides en cadena (catenulata) o en falsas cabezas (chlamydosporia).

Gams (1988) valoró que estas diferencias tienen un limitado peso y no siempre pueden definir, por si solos, entre los aislamientos, por lo que propuso considerar a chlamydosporium y catenulatum como variedades de una misma especie, V. chlamydosporium. Este criterio lo mantuvo Gams y Zare, (2001) al reubicar esta especie en el género Pochonia.

El nombre del género anterior de esta especie es compartido con patógenos importantes de planta como Verticillium dahliae (Kleb.) y Verticillium albo-atrum Reinke y Berthold, por lo que renombrarlo favorece los procesos de registros y de aplicación en el campo de este hongo como ACB (Montes de Oca, 2004).

1.3.2 Mecanismo de acción de P. chlamydosporia

P. chlamydosporiaparasita huevos de nematodos formadores de agallas formando apresorios, desarrollados a partir de la hifa indiferenciada que permite la colonización de la superficie de los huevos de los nematodos (Morgan-Jones y col., 1983). Sin embargo, la penetración, es el resultado de una presión física y una actividad enzimática. Una enzima proteasa serina alcalina (subtilasa) designada como VCP1 ha sido parcialmente caracterizada y en pruebas in vitro demostró remover la membrana vitelina más externa de la cáscara del huevo y expuso la capa de quitina de nematodos formadores de agallas de raíces (López-LLorca y Robertson, 1992; Segers y col., 1996).

Se piensa que VCP1 pudiera explicar el rango de hospedante o de virulencia. Diferentes aislamientos de P. chlamydosporia difieren marcadamente en la producción de esta enzima y en la capacidad de parasitar los huevos en simples pruebas en placas Petri con agar (Kerry, 2001). Recientemente Morton y col., (2003) secuenciaron el gen que codifica para la producción de VCP1 y demostraron estas diferencias. Enzimas similares han sido identificadas en otros hongos nematófagos (López-LLorca, 1990; Segers y col., 1999).

En general, todos los aislamientos infectan huevos inmaduros más ágilmente que a huevos maduros. Los juveniles de segundo estado escapan a la infección a temperaturas cercanas a 30ºC, porque eclosionan antes que la masa de huevo sea totalmente colonizada y los nematodos en fases móviles no son parasitados por el hongo (Kerry y Bourne, 2002). Por lo tanto, es necesario seleccionar el aislamiento para la plaga blanco específico y las condiciones en las cuales este podría ser aplicado

Este aislamiento coloniza raíces, suelos y parasita huevos en porcientos Peteira et. al, 2004, Montes de Oca, 2004.

1.3.3 Estudios de la especie P. chlamydosporia en las condiciones de Cuba.

El primer informe de la presencia de esta especie en Cuba es publicado por Cabrera y col., (1987) al encontrar a P. chlamydosporia colonizando masas de huevos (ootecas) de M. incognita en guayaba. Posteriormente Hidalgo y col., (1998), informan la presencia de las dos variedades (chlamydosporia y catenulata) parasitando huevos de M. incognita en el cultivo del tomate en la provincia de la Habana y en suelos cafetaleros de Santiago de Cuba.

Estos estudios se continuaron, informándose posteriormente más de 80 aislamientos con una gran variabilidad específica e Inter.-específica en este género, notificando la presencia de tres especies y dos variedades: P. chlamydosporia var. chlamydosporia (Goddard) Zare y G. Gams; P. chlamydosporia var. catenulata; P. suchlasporia var. catenata (W. Gams y Dackman) Zare y W. Gams y Lecanicillium psalliotae (Treschow) G. Gams y Zare (Hidalgo y col., 2000).

En sentido general, los aislamientos cubanos presentaron gran producción de clamidosporas, mayor intensidad en la coloración de las colonias, con predominio de colores ocráceos, sobre todo la variedad catenulata, al ser comparadas con las descripciones realizadas por Gams (1988).

En el propio estudio Hidalgo y col., (2000) describieron que algunos aislamientos de la variedad catenulata presentaron características peculiares no informadas anteriormente, como son la producción de clamidosporas inusualmente grandes y escasas sobre pedúnculos generalmente cortos y ensanchados cerca del tope y la presencia de conidióforos erectos, con fiálides ligeramente más cortas y ensanchadas en la base. Estos aislamientos fueron considerados como un nuevo biotipo, denominado como P. chlamydosporia var. catenulata biotipo A.

Entre todos los aislamientos estudiados por este autor, se seleccionó a la cepa Vcc-108 de la var. catenulata como la más promisoria con un 68% de huevos de M. incognita parasitados en condiciones semicontroladas y el 70% de las masas de huevos colonizadas sobre la rizosfera del tomate, después de seis meses de aplicado el hongo en una sucesión de cultivos (Atkins y col., 2003).

(Cortesía del Dr. Leopoldo Hidalgo-Díaz)

Con esta cepa se han desarrollado metodologías de reproducción masiva en bandejas mediante formulación sólida (Hidalgo, 2000), y posteriormente mediante una tecnología de Fermentación en Estado sólido en Bolsa (FESB), la que permitió obtener mayores rendimientos y desarrollar ensayos de campo a mayor escala en las áreas agrícolas del CENSA (Hidalgo y col., 2004). En estos ensayos de campo se ha demostrado que con una sola aplicación del hongo a razón de 5000 clamidosporas por gramo de suelo, después de dos ciclos consecutivos de tomate este logra infestar más del 60% de los huevos expuestos en la rizosfera, reduciendo significativamente el número de juveniles en el suelo (Peteira y col., 2004).

Estos resultados sientan las bases para una posterior optimización de la producción, formulación y registros de productos bionematicidas a partir de esta cepa.

 1.3.4 Métodos para el aislamiento, identificación y estudio del potencial de P. chlamydosporia

Para la identificación morfológica de P. chlamydosporia, el uso de técnicas microscópicas es el método más utilizado en la actualidad; pero precisa de gran cantidad de tiempo y de personal altamente experimentado en el estudio de cada aislamiento (Atkins y col, 2002), y ha resultado inexacto para la ubicación taxonómica de los hongos en general. Tanto el uso de medios de cultivos, como la observación macro y microscópica de los caracteres morfológicos para la identificación de las diferentes especies nematopatógenas de Pochonia, resultan engorrosos por las pequeñas diferencias morfológicas entre ellas (Kerry y col., 1995; Bourne y col., 1996).

Esto hace necesario la búsqueda de métodos más sensibles y rápidos para su detección, utilizándose entonces las técnicas moleculares que explotan la variación en los genes del ADN ribosomal o mitocondrial (White y col., 1990) y que son sensibles, factibles y más rápidas que los métodos convencionales para identificar cepas de hongos incluyendo a Pochonia (Morton y col., 1995).

Ensayos basados en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) fueron desarrollados para diferenciar la diversidad de la secuencia ITS presentes en diferentes especies de Verticillium (Nazar y col., 1991; Robb y col., 1993; Moukhamedov y col., 1994). Particularmente, Arora y col. (1996) lograron diferenciar aislamientos de P. chlamydosporia de otros hongos del suelo. Posteriormente, una secuencia parcial del gen β tubulin de los hongos fue obtenida, facilitando el desarrollo de un ensayo por PCR para el diagnσstico específico de la variedad chlamydosporia a partir de material de planta infestado con el nemátodo y propágulos del hongo en el suelo (Hirsch y col., 2000).

Para el conocimiento de las interacciones tritróficas entre el hongo la planta y el nemátodo se hace necesario visualizar el hongo in situ, es por ello que se estudia la aplicación de aislamiento de hongos que contengan genes marcados o el uso de anticuerpos monoclonales (Hirsch y col., 2001). Sistemas de transformación de P. chlamydosporia se han descrito para viabilizar estos objetivos (Atkins y col., 2000). Recientemente se desarrolló un ensayo por PCR-competitivo para su cuantificación en el suelo (Mauchline y col., 2002).

Los métodos desarrollados hasta el presente, tienen la limitante de no poder informar sobre el estado fisiológico del hongo y de no ser específicos para detectar aislamientos de la variedad catenulata. Por lo que se necesita profundizar en el estudio de estas técnicas antes de ser usadas como instrumentos para la caracterización y detección de diferentes aislamientos de P. chlamydosporia.

Para el aislamiento y estimación de la concentración de P. chlamydosporia en el suelo o sobre la raíz se estudiaron diferentes medios de cultivos (de Leij y col., 1992), que resultaron ser inefectivos (Nadakavukaren y Horner, 1959; Menzies y Griebel, 1967 y Christen, 1982). Solo un medio semiselectivo desarrollado por Kerry y col., (1993), logró distinguir las colonias de esta especie del resto de la microflora del suelo. Estableciéndose como el mejor método de cuantificación a la combinación de dilución y conteo en medios selectivos (Butterfield & DeVay, 1977; Gaspard, y col., 1990; Kerry y col., 1993). Sin embargo, tienen la limitante de no detectar el hongo por debajo de 500 Unidades Formadoras de Colonias (UFC) por gramo de suelo y de que el número de UFC detectadas es muy superior al número de clamidosporas aplicado, teniendo en cuenta que tanto fragmentos de hifas como conidios pueden dar lugar a una colonia.

Figura 3. Crecimiento de la cepa IMI SD: 187 a los 21 días de incubación a 25ºC en medio Semiselectivo.

Una relación de estudios sobre la caracterización cultural, morfológica y diferenciación molecular realizados con la cepa IMI SD 187, son parte de los indicadores de calidad que garantizan la identidad y pureza de la cepa e inoculo utilizado en los procesos de fabricación y aplicación en campo (Montes de Oca, 2004).

Para caracterizar el potencial de este hongo en el suelo, se necesita conocer su relación cuantitativa con respecto a la rizosfera de la planta y a la plaga (Waage y Greathead, 1988). La estimación de los cambios en la densidad del hongo precisa de técnicas de extracción física de clamidosporas del suelo (Crump y Kerry, 1981) y de la estimación del número total de propágulas en el suelo o en raíz (Kerry y col., 1993). Sin embargo estos métodos solo son capaces de detectar cambios relativos en la abundancia del hongo y no se pueden relacionar con su actividad.

Para la determinación de la producción de clamidosporas a partir de muestras de suelos, se han explorado ensayos de centrifugaciones con la ayuda de sulfato de magnesio y de tinciones, después se aplican métodos de conteo de células al microscopio óptico, como el uso de la cámara de Neubauer. Con este método algunas veces se dificulta la identificación de las clamidosporas, por la interferencia de otras partículas que están presentes en el suelo, con el inconveniente de que es un proceso que consume tiempo. El método varía con el tipo de suelo, el cultivo y los tratamientos (Kerry y Bourne, 2002).

Estos mismos autores refieren que el parasitismo de huevos de nematodos por P. chlamydosporia, se ha establecido como el método de rutina para evaluar la actividad biológica. El cual se basa en la siembra del hongo en placas Petri con medio de cultivo, donde se enfrentan huevos del nematodo y el hongo, determinando el porcentaje de parasitismo. En este método la dificultad estriba en la extracción de los huevos de las masas logrando la concentración deseada, sin que se afecte la pared del mismo, práctica que influye grandemente en la calidad del ensayo. Otros métodos se han utilizado, pero todos concluyen con este procedimiento.

Con la utilización de este método se han obtenido valores de 68% de parasistismo in vitro y controlado en macetas para la cepa Vcc-108 (IMI SD 187) de P. chlamydosporia (Montes de Oca, 2004), en experimentos de campo se informan porcentajes sueperiores al 70% (Kerry e Hidalgo, 2004).

Para la estimación de poblaciones de nematodos en el suelo, se utiliza el método de extracción por bandeja, que es simple, rápido y puede utilizarse gran cantidad de muestras de suelos. Otros ensayos, solo permiten el uso de pocas cantidades de suelo como el de flotación y esto hace que la muestra no sea representativa (Whitehead y Hemming, 1965).

La estimación de las poblaciones de nematodos en raíces puede ser de diferentes formas: masa de huevos por gramo de raíz, huevos por masas de huevos, % de huevos infectados y el número de adultos y juveniles en el sistema de la raíz.

Se conoce que la planta hospedante tiene efecto directo e indirecto sobre el crecimiento del hongo en la rizosfera. En general las plantas difieren en su habilidad para soportar el crecimiento del hongo y este es más abundante sobre raíces infectadas por nematodos comparadas con aquellas no infectadas, no está claro, si el incremento en la densidad del hongo resulta de la colonización directa de la masa de huevos o de la liberación de nutrientes en la rizosfera. En la interpretación de los resultados de estos métodos, es imprescindible tener en cuenta los niveles de presencia del nematodo, el tipo de cultivo y en general las interacciones tritróficas que se establece entre el hongo, la planta y la plaga (Kerry, 2001).

Diferentes grupos de investigadores en el mundo desarrollan novedosos bioensayos y combinaciones con métodos clásicos para el aislamiento, identificación, detección y monitoreo de esta especie como elemento esencial para dilucidar el papel de las variaciones del hongo en la regulación de las poblaciones de nemátodos.

La obtención de cebadores específicos ha permitido la identificación y diferenciación de la variedad chlamydosporia, así como de otros hongos del suelo (Atskins et al., 2003). Estos métodos moleculares unidos a medios de cultivos específicos para este hongo, fortalecen el control de la calidad de la cepa y para la vigilancia post aplicación del producto bionematicida (Montes de Oca, 2004)

En la actualidad se continúa con el desarrollo de metodos más precisos y factibles que faciliten el estudio de los aislamientos de esta especie con potencialidades como ACB de nematodos formadores de agallas.

1.3.5 Métodos para el mantenimiento y conservación de las capacidades de P. chlamydosporia como ACB.

Para asegurar la viabilidad, estabilidad y consistencia del ACB o de los productos que se deriven, lo primero es seleccionar el método de conservación y los procedimientos de manejo y vigilancia adecuada para conservar las características originales por las que fue seleccionado.

En el caso de la especie P. chlamydosporia se han utilizado varios métodos para su conservación, algunos de tiempo corto que involucran la conservación del hongo sobre agar cubierto con agua o aceite mineral a 4ºC. Estos métodos son relativamente rápidos, fáciles y no requieren de equipamiento especial. Sin embargo, no siempre el hongo logra sobrevivir por largos períodos de tiempo en estas condiciones (Kerry y Bourne, 2002).

La colección de P. chlamydosporia de la Estación Experimental de Rothamsted (Reino Unido) han sido conservados por más de 5 años sus aislamientos por los métodos de liofilización, crio-preservación y en subcultivos sobre medios agarizados a 4ºC. De igual manera Hidalgo (2000), estableció los métodos de subcultivo y liofilización para la conservación de la colección de Pochonia y Verticillium conservadas en el Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA).

El subcultivo es un método sencillo y utilizado tradicionalmente para la preservación de microorganismos, el cual consiste en la transferencia del hongo a un medio de cultivo fresco a intervalos que aseguren su viabilidad. Estos intervalos varían dependiendo de las características del microorganismo en cuestión. Esta frecuencia puede reducirse con el almacenamiento del subcultivo a temperaturas relativamente bajas, a 40C o entre –100C y –800C, bajo aceite mineral o agua (Snell, 1991).

A pesar de las ventajas asociadas al uso de este método, hay que tener presente la posibilidad de perder el microorganismo por el riesgo de contaminación y de cambios genéticos que se incrementa a mayor número de transferencias; la posible inoculación con el microorganismo equivocado cuando se trabaja con muchas cepas a la vez y la deshidratación del medio de cultivo; entre otros (Smith y Onions, 1994).

Uno de los efectos que puede ocasionar la transferencia periódica del cultivo, es la formación de zonas con características diferentes al resto del micelio y cambios en la capacidad para producir metabolitos secundarios y enzimas. Estos sectores son frecuentes durante el crecimiento de colonias de hongos mitospóricos en medios agarizados y en ellos se observan diferencias en sus características culturales y morfologicas, que pueden ser ausencia de esporulación, entre otras (Grendle, 1964; Gramss, 1991; Kim, 1997; Ryan y col., 2002).

Autores como Prosser (1993) concluyen que este fenómeno puede resultar de un crecimiento atípico a través de mecanismos que no están aún bien explicados. Kirn y col., (2001) describieron la formación de sectores como una "mutación". También se han informado aislamientos de hongos que no han tenido cambios en sucesivos subcultivos (Hall, 1980) o que pases a través del hospedero pueden mejorar la virulencia y expandir el rango de hospedante (Aizawa, 1971; Ferron, 1985).

El otro método de conservación más utilizado es la liofilización, el cual varia sus condiciones con las características físico-químicas del medio de suspensión, el tipo de microorganismo, el estado fisiológico del cultivo, las condiciones del cultivo y la concentración de los microorganismos, entre otros (Sly, 1992). En el caso de P. chlamydosporia se usan como medio de suspensión el Caldo Nutriente suplementado con glucosa al 7.5% (Kerry y Bourne, 2002). Este método es uno de los más eficaces para la conservación de muchos tipos de microorganismos, como: bacterias, hongos, bacteriófagos y virus; algunos de ellos pueden sobrevivir por períodos de más de 40 años. Sin embargo, el proceso es complejo y caro, pues requiere de un equipo de liofilización, por lo que no se puede aplicar en laboratorios con recursos limitados (Smith y Onions, 1994).

La mayoría de los métodos de preservación logran reducir el ritmo metabólico de los organismos por retención de nutrientes, agua y oxígeno; por reducción de la temperatura de conservación; o por combinación de ambos. Ellos tienen una tendencia inherente a mutar en cultivos de laboratorio, por lo que es muy importante el uso de procedimientos para vigilar y asegurar su viabilidad y estabilidad genética (Sly, 1992). Las propiedades conocidas del microorganismo deben chequearse periódicamente y siempre que sea posible, aquellas que puedan variar en el tiempo (Smith, 1996).

Las colecciones de cultivos deben desarrollar programas de investigación para determinar y asegurar la estabilidad de las cepas, requisitos exigidos por los órganos de registros (FAO, 1988; EPA, 1996; OECD, 1996 y CNSV, 2001b).

En sentido general los protocolos de estabilidad deben evaluar periódicamente las características culturales, morfológicas, de viabilidad, pureza, identidad, velocidad de mutación, cambios enzimáticos o moleculares de las cepas, entre otros, para cada método de conservación. Estos estudios aportan información necesaria para obtener la licencia de investigación, desarrollo, producción y aplicación de los ACB y aseguran la continuidad de los productos.

1.4 Limitaciones en el desarrollo de bioplaguicidas a partir de hongos.

Dentro del grupo de bioplaguicidas de origen microbiano se destaca el uso de los hongos como agentes de control biológico por su amplio número de géneros y especies eficaces en el control de diferentes plagas, pero pocos se han logrado producir y aplicar de forma estable y masiva (Goettel y col., 2001).

De igual manera existe un número considerable de hongos antagonistas de fitonemátodos con potencialidades para el control biológico, y un gran interés en su aplicación (Duncan, 1991). Sin embargo, ninguno es ampliamente usado en la práctica agrícola (Kerry y Jaffee, 1997; Whitehead, 1997; Fravel, 1999), debido fundamentalmente al deficiente conocimiento entre otros aspectos de: modo de acción, producción de metabolitos y eventos o condiciones que afectan su actividad como bioplaguicida (Mena y col., 1996; López-LLorca y Olivares-Bernabeu, 1998).

Para la aplicación de estos productos, se necesitan grandes volúmenes de fermentaciones, que a su vez son procesos de bajos rendimientos y altos costos de producción (Jackson, 1997), y en la mayoría de los casos tienen poca consistencia (procesos repetibles) y baja estabilidad (Jenkins y col., 1998), debido al poco desarrollo de métodos de producción masiva adecuados, estudios de escalados y formulación (Fernández-Larrea, 2001), entre otros.

A pesar de todas las limitaciones referidas, en el mundo numerosos grupos de investigadores y empresas productoras se concentran en el desarrollo de productos comerciales a partir de hongos entre los que se citan: Biofox C (Fusarium oxysporium Schlect y Fusarium moniliforme Sheldon, SIAPA, Italia), Mycotal (Lecanicillium lecanii (Zimmerm) Zare y Gams, Koppert, Holanda), Mycotrol GH (Bauveria bassiana (Bals) Vuill, Mycotech, EUA), Green Muscle (Metarhizium flavoviride Gams y Rozsypal, CABI Bioscience, Reino Unido), entre otros (Burges, 1998; Butt y Copping, 2000).

Dentro de los bioplaguicidas con efecto nematicida se encuentran entre otros DiTera (Myrothecium verrucaria Ditm., Valent-Sumitomo, EUA-Japón), (Burges, 1998; Butt y Copping, 2000). El PAECYL, PL PLUS, BIOACT o Nemacheck, (P. lilacinus, Filipinas-Australia) (Holland, 2001).

En Cuba están en proceso de registro productos como el HeberNem (T. paurometabolum, CIGB Camaguey) (Mena y col., 2002) y el KlamiC (P. chlamydosporia, CENSA) (Hidalgo, 20041), con resultados alentadores en el control de M. incognita.

Se puede resumir que las limitaciones, son de orden técnica, de registro y comerciales, logrando avanzar aquellos ACB que tienen una alta velocidad de acción, persistencia, tolerancia, mecanismo de acción definido, estudios de seguridad (Toxicología y Ecotoxicología), un mercado viable y una demanda basada en el número de plagas o enfermedades que controla, así como costos eficientes de producción (Powell y Faull, 1989).

Se añaden a estas limitaciones la poca utilización de sistemas de gestión de la calidad con la aplicación eficiente de estos conceptos en las diferentes fases de desarrollo de estos productos.

Por tanto, para viabilizar esta alternativa dentro de las estrategias de manejo de plagas es necesario un ímpetu significativo para mantener el interés y resultados concretos que se han ido materializando en productos seguros y eficaces como estrategia sostenible para nuestra agricultura.

1.4.1 Tecnologías de producción de hongos ACB

De forma general en la fabricación de bioplaguicidas a partir de hongos se busca la producción apropiada de inóculos, formulación y aplicación de tecnologías apoyados en un control de la calidad efectivo (Whipps y Lumsden, 2001).

Una de las etapas más difíciles de vencer, es la obtención de una tecnología de producción masiva a gran escala, que permita cantidades suficientes de un inoculo de calidad que sea consistente y compatible con la propuesta de formulación y aplicación (Jenkins y col., 1998).

Se reconocen varias tecnologías de producción; las más usadas para hongos son a partir de soportes sólidos (Fermentación en Estado Sólido-FES), en cultivos líquidos sumergidos (Fermentación Líquida) o combinaciones de ambos (Fermentación Bi-Fásica) (Nagel, 2002). Estos métodos generalmente se consideran artesanales o semiartesanales atendiendo al número de manipulaciones que involucran. Cada método tiene ventajas y desventajas, lo más importante es la calidad del producto final y su factibilidad tecnológica y económica (Fernández-Larrea, 2001).

1 Dr. Leopoldo Hidalgo. Especialista de control biológico de nematodos. Protección de Plantas, CENSA. Cuba (Comunicación Personal)

Lo primero es contar con un buen aislamiento que mantenga su virulencia y homogeneidad (Shieh, 1989) y a partir de aquí desarrollar el sistema de producción, para lo cual se necesita conocer los requerimientos de nutrición, pH, actividad del agua, contenido de humedad en el sustrato, temperatura óptima de crecimiento y esporulación, influencia de la luz, aire, entre otros (Johnpulle, 1938; Barlett y Jaronski, 1988; Latgé y Moletta, 1988; Kleespies y Zimmermann, 1992).

Muchos trabajos optimizan estos parámetros a pequeña escala en frascos Enlermeyer, que generalmente producen gran cantidad de datos, pero no son repetibles al aumentar la escala productiva. Una razón para esto es que aumenta el volumen de sustrato y por tanto los niveles de aireación son más difíciles de mantener, aparecen problemas físicos en las operaciones de esterilización y las técnicas asépticas son difíciles de asegurar (Jenkins y col., 1998).

Estos autores también plantean que la fermentación bifásica tiene la ventaja de expresar los contaminantes del cultivo patrón, facilitando la colonización y conidiación y reduciendo el tiempo de incubación.

Los requerimientos para el sustrato depende de varios factores: factibilidad local, costo, preferencia del aislamiento, hidratación y esterilización. Se pueden usar sustratos no nutritivos o nutritivos. Estos últimos tienen alta concentración de contaminantes (Jenkins y Lomer, 1994).

La producción de esporas tiene un requerimiento especial en cuanto a la tolerancia a la desecación, lo que puede estar asociado a las condiciones nutricionales durante el crecimiento del cultivo y la esporulación. Por tanto, la optimización del sustrato para la producción masiva no solo actúa sobre el rendimiento, sino también sobre la calidad de la espora (Jackson, 1997).

Otros elementos como la aireación mejoran la velocidad de la esporulación y ayudan a remover los excesos de calor. Estos sistemas deben usar aire estéril y húmedo para evitar introducir contaminaciones y desecación prematura del sustrato (Bradley y col., 1992 y Guillon, 1997). El contenido óptimo de humedad depende de la relación hongo-sustrato, este elemento tiene un papel significativo en el rendimiento y su optimización es complicada. Los rangos del porcentaje de agua en el sustrato húmedo se encuentran entre 35 y 60% (Moo-Young y col., 1983). La temperatura y la luz varían con el tipo de microorganismo (Thomas y Jenkins, 1997).

La mayoría de los procesos productivos que utilizan el sistema bifásico se componen de operaciones de inoculación, incubación, secado y extracción. Evaluando parámetros productivos y de calidad como: el rendimiento (# de conidios producidos/g o Kg de sustrato, calculado como el valor promedio sobre el número de ciclos de producción), concentración de conidios en el producto final (# de conidios producidos/g o Kg de producto final), capacidad de manejo del sustrato (# de Kg de sustrato usado en cada lote, calculado como el promedio sobre el número de lotes), salida (# máximo de lotes posibles por año). Los controles de calidad mínimo que se recomiendan son: identidad, estabilidad y pureza del cultivo patrón, monitoreo de la contaminación durante el proceso, concentración de contaminantes viables totales, viabilidad de la espora y la virulencia/patogenicidad del producto. Otros pueden ser contenidos de agua, cantidad de ingrediente activo/g de producto y el tamaño de la partícula. (Cherry y col., 1999).

Otros elementos a tener en cuenta son los datos económicos de cada lote y el conocimiento de la dosis de aplicación en el campo (Cantidad o # de g de producto aplicado por hectárea o por área tratada) (Jenkins y col., 1998).

Cada elemento que interviene en la fabricación requiere de un grupo de condiciones y requisitos que deben ser bien estudiados y demostrados para cada aislamiento, método productivo y escala. En todos los casos, es necesario contar con un método de conservación adecuado para la cepa y estar reconocido en una colección con depósito seguro y acceso no autorizado. Tener establecido una tecnología con la presencia durante todas las operaciones de los controles de proceso y los de calidad del producto final expresados en las especificaciones y la implementación de un efectivo sistema de calidad que abarque los elementos de la preproducción y post aplicación del producto.

1.4.2 Problemática en Cuba en la producción de hongos bioplaguicidas

En Cuba a partir del año 1959 se impuso un nuevo orden social que revolucionó la agricultura (Oppenheim, 2001). En la década del 80 se implementó con mayor fuerza el manejo integrado de plagas como estrategia para la reducción de plaguicidas químicos (Rego y col., 1986), incrementándose el uso de los bioplaguicidas (Rosset y Bourque, 2001). Años después se crean los CREE para la producción artesanal de ACBs y la comercialización a cooperativas agrícolas y campesinos privados (Pérez y Vázquez, 2001), lo que le ha permitido al país contar con recursos propios en un campo tan importante como la protección fitosanitaria de los cultivos (Fernández-Larrea, 2002).

Numerosas investigaciones se han conducido en la producción, formulación, control de la calidad y aplicación de numerosas bacterias y hongos que incluyen a B. thuringiensis, B. bassiana, Metarhizium anisoplae (Metsch.) Sorok, L. lecanii y Trichoderma harzianum Rifai (Global Exchange Delegation Members, 1996; Fernández-Larrea, 2004).

Estas pequeñas producciones se realizan con bajos insumos y facilidades mínimas instaladas y su uso es limitado a regiones pequeñas. Cuentan con el Manual de métodos para la producción de entomófagos y entomopatógenos (INISAV-CNSV-MINAGRI, 1991) y normas y programas para realizar el control de la calidad. Hasta hace poco tiempo estos biopreparados no requerían ser registrados, por lo que las exigencias eran mínimas para su obtención y aplicación.

A partir de la prioridad del gobierno de estimular esta estrategia se han dado pasos importantes como son: la definición, dentro del Programa de Biotecnología Agrícola, del tema de investigación "Obtención y Desarrollo de Bioplaguicidas, Biofertilizantes, Biorreguladores y Extractos Naturales", y la aprobación de la Guía para el Registro de los Plaguicidas Microbianos (CITMA, 1995; CNSV, 2001b).

El Comité Asesor del Registro de Plaguicidas Microbianos (CNSV, 2001a) evaluó los principales problemas para lograr la implementación de esta guía, dentro de los que definió: pobre definición de las formulaciones y formas finales del producto; poca información sobre el mecanismo de acción; no se expresan los métodos y precauciones sobre la manipulación, almacenamiento y transportación de los productos; no se hacen ensayos para demostrar que el producto está exento de patógenos humanos; no se expresan los procedimientos de descontaminación y limpieza de equipos, entre otros.

Lo que sostiene, que además de faltar información técnica, que se obtiene en las fases de investigación-desarrollo, las fabricaciones adolecen de la experiencia en el diseño e implementación de los conceptos de calidad, no aplicando BPF, aspecto que debe ser abordado en la producción de bioplaguicidas en Cuba.

5. Los sistemas de gestión de la calidad y la producción.

La calidad y el desarrollo económico crecen íntimamente ligados, creándose una carrera por el perfeccionamiento de los productos y servicios, a tal punto que muchos países consideran a la calidad como un objetivo nacional, siendo el mayor cambio que deben experimentar en el futuro todas las naciones (Villoch, 1998). Para llevar una organización al éxito se requiere que esta se dirija y controle de forma sistemática y transparente, logrando implementar y mantener un sistema de gestión que esté interesado en una mejora continua de su desempeño considerando las necesidades de todas las partes interesadas (NC ISO 9000, 2000).

La norma cubana NC ISO 9000:2000 describe los fundamentos y vocabulario aplicables a los sistemas de gestión de la calidad. Los conceptos de calidad aplicados en este trabajo son tomados de dicha norma.

En ella se define como Gestión a las actividades coordinadas para dirigir y controlar una organización. La gestión de una organización comprende la gestión de la calidad, recursos humanos, financieros, rentabilidad, medio ambiente, seguridad y salud ocupacional entre otras disciplinas. La integración de estos aspectos en el sistema de gestión de la organización puede facilitar la planificación, la asignación de recursos, el establecimiento de objetivos complementarios y la evaluación de la eficacia global de la misma.

En general, los principales planteamientos de la Gestión de la Calidad radican en que la calidad no es una función técnica, ni un departamento o programa de conciencia, sino un proceso sistemático, ligado al cliente, que se debe poner en practica total y rigurosamente en la compañía entera, integrando a los suministradores (Feigenbaum, 1991).

La Calidad es el grado en el que un conjunto de características inherentes cumple con los requisitos, entendiéndose por Característica a un rasgo diferenciador que puede ser inherente o asignado, clasificada como: físicas, sensoriales, de comportamiento, de tiempo, ergonómicas y funcionales. Y como Requisitos de la Calidad a la necesidad o expectativa establecida, generalmente implícita u obligatoria, los que permiten la evaluación y el control de las necesidades de mercado, el cliente, de relaciones contractuales, de desempeño, disponibilidad, mantenimiento, fiabilidad, además de las de seguridad en el uso, para la sociedad y el medio ambiente.

Para el diseño de sistemas de gestión de la calidad, se ha elaborado la familia de Normas ISO 9000. Dentro de ellas, la ISO 9001 debe aplicarla aquella organización independiente de su tipo o tamaño que necesite demostrar su capacidad para proporcionar productos que cumplan los requisitos de sus clientes y los regulados para ella, la que puede complementarse con la ISO 9004 (mejora continua) y la ISO 19011 (auditorias), entre otras (NC ISO 9000, 2000).

Estas normas no especifican los requisitos para el producto, el que puede definirse por el cliente, la propia organización o por disposiciones reglamentarias. Los requisitos para los productos y en algunos casos los procesos asociados pueden estar contenidos en especificaciones técnicas, normas de productos, normas de proceso, acuerdos contractuales y requisitos reglamentarios. Se define como Producto al resultado de un proceso el que se entiende como conjunto de actividades mutuamente relacionadas que interactúan, las cuales transforman elementos de entrada en resultados.

Para lograr calidad, que conlleve la satisfacción del cliente a través de un enfoque de proceso, es necesario realizar en la empresa una Gestión de la Calidad que generalmente incluye el establecimiento de la política y objetivos, la planificación, el control, el aseguramiento y la mejora de la calidad (Juran, 1993; NC ISO 9000, 2000)

La Planificación de la Calidad está enfocada al establecimiento de los objetivos de la calidad y a la especificación de los procesos operativos necesarios y de los recursos relacionados para cumplir los objetivos de la calidad. El Control de la Calidad es la parte orientada al cumplimiento de los requisitos de la calidad. El Aseguramiento de la Calidad, es la parte de la gestión de la calidad enfocada a proporcionar confianza en que se cumplirán los requisitos de la calidad y la Mejora de la Calidad, es para aumentar la capacidad de cumplir con los requisitos de la calidad. (NC ISO 9000:2000)

La aplicación de estos conceptos describe los componentes que deben incluir los sistemas de gestión de la calidad, pero cada organización tiene libertad para diseñarlos y aplicarlos según sus condiciones específicas. Se convierte en una clave para el éxito de un negocio, porque permite elevar la productividad, reducir los costos e incrementar las ventas y los beneficios, en un mundo donde el cliente está en la posición de escoger.

1.5.1 Aplicación de conceptos de calidad a la industria de Bioplaguicidas

Las industrias que generan productos que intervienen directamente en la seguridad de los consumidores han estado sometidas a un fuerte control estatal, para demostrar la seguridad y confiabilidad de sus producciones, conociéndose como industrias reguladas (Lauzan, 1996). Así surgió en 1962 el primer documento de Buenas Practicas de Producción (BPP) en la industria de producción de medicamentos, que no es más que una recopilación de los requisitos mínimos de aseguramiento de la calidad para este tipo de industria (CECMED, 2000).

No debe desconocerse que con el desarrollo de la tecnología y los conocimientos del hombre, otras industrias pueden irse incorporando en este grupo expresamente controlado por los Estados. Las tendencias indican que las producciones de bioplaguicidas están en esta vía, pues son productos que pueden influir en la seguridad del ambiente y el hombre. Sin embargo, a pesar de que se han ido estructurando regulaciones para el otorgamiento de licencias de fabricación (Bode, 1997; Hamer, 1997), aún se informan insistentemente dificultades con algunos de estos productos, lo que no permiten un amplio uso (Kerry, 2001).

Ocurre que muchos de ellos están catalogados por el mercado como débiles por su baja eficacia y cuestionable control de la calidad, lo cual influye en la pobre imagen de la industria de bioplaguicidas (Harris, 1997; Foster, 2001). En la mayoría de los países del Tercer Mundo que fabrican bioplaguicidas para el control de plagas, tienen dificultades en la consistencia y calidad de sus productos finales porque no se aplican sistemas que aseguren su calidad (Jenkins y Gzywacz, 2000).

Considerando las condiciones que implican por una parte la globalización del mercado mundial y las necesidades de las producciones agrícolas de nuestra economía nacional, el establecimiento de sistemas de calidad en las producciones en este sector se constituyen en una actividad estratégica.

Es significativo que, en las experiencias que se han señalado en estas producciones, no se encuentra que hayan explotado la posibilidad de establecer guías de Buenas Prácticas, aunque se ha señalado el uso de las Buenas Practicas de Laboratorio (BPL) (FAO, 1988; EPA, 1996; OECD, 1996 y CNSV, 2001b), lo que indica que tampoco hay claridad en la concepción y origen de estos conceptos. Las BPF son regulaciones que recogen los requisitos mínimos recomendados para lograr producciones eficaces y seguras (CECMED, 2000; OMS, 2003) y dentro de ellas se encuentra el cumplimiento de las BPL.

La implementación de una guía de BPF para la producción de bioplaguicidas, tiene la ventaja de establecer requisitos generales que puedan ser asumidos por una gran diversidad de procesos productivos y por otra parte, establece pautas que son una plataforma adecuada para lograr producciones de calidad. La estructuración de las BPF se considera un primer paso para llegar a un Sistema de Gestión de la Calidad (cecmed, 2000).

Una característica esencial de la producción de cualquier ACB es contar con un eficiente control de la calidad, porque ayuda a maximizar la eficiencia del producto, estandarizar los costos de producción y lograr consistencia a través de ciclos productivos repetibles. Sistemas que están fuera de control pueden obtener productos con concentraciones variables del principio activo, riesgos para la salud del consumidor y por tanto la perdida de confianza por el cliente (Jenkins y Grzywacz, 2000).

El Aseguramiento de la Calidad consiste en garantizar que todas las operaciones de la producción sean reproducibles y logren resultados similares en cada lote. Como parte del Aseguramiento de la Calidad, la norma cubana NC ISO 9001 (2000) plantea algunos elementos esenciales como son: garantizar el establecimiento de un proveedor que suministre las calidades especificadas de las materias primas y materiales, la calibración de todos los medios de medición, el manejo adecuado de las materias primas, la capacitación y preparación del personal, el establecimiento de los controles de proceso, el control del comportamiento del producto una vez aplicado, además de las evidencias documentadas de las operaciones realizadas, entre otros.

En los controles establecidos se debe definir los métodos de control y los criterios de aceptación (NC ISO 9001, 2000). Los rangos o límites de los puntos de control se pueden establecer teniendo en cuenta las regulaciones, trabajos científicos, estudios realizados en la propia planta de producción o de datos históricos de los procesos productivos (Inda, 1999), apoyados en las herramientas del control estadístico de la calidad (Montgomery y Klatt, 1972; Shewhart, 1980; ISO, 1995).

En estos momentos, debido a las pocas regulaciones dirigidas a esta industria en el mundo, el establecimiento de las especificaciones de calidad de cada bioplaguicida depende de lo definido por cada empresa productora (Jenkins y Grzywacs, 2000). De forma general el control de la calidad del producto final debe responder a dos elementos claves: la seguridad y eficacia.

Como se ha planteado, la aplicación de un sistema de Gestión de la Calidad es útil para cualquier tipo de organización y de producciones, por lo que si la industria de bioplaguicidas asume estos conceptos se beneficiaría de todas las ventajas descritas anteriormente. Sin embargo, no se refieren muchas experiencias en el ámbito mundial de su aplicación, por el contrario abundan los casos de producciones con dificultades en la consistencia de sus procesos y producto final que mejorarían sustancialmente con la aplicación de un Sistema de Gestión de la Calidad.

Demostrar que sistemas de bajas tecnologías productivas en países en desarrollo pueden obtener productos de calidad, partiendo de la implementación adecuada de conceptos de calidad, es una estrategia necesaria para una agricultura sostenible.

En este sentido se estableció una tecnología de producción insertada dentro de un Sistema de Gestión de la Calidad para la fabricación de un producto nombrado KlamiC que ha demostrado ser efectivo y seguro.

CONCLUSIONES

A partir de todos los estudios y resultados obtenidos se cuenta hoy con un producto fitosanitario (KlamiC) a partir de la cepa Vcc-108 de Pochonia chlamydosporia var catenulata efectivo y seguro para el control de nematodos agalleros y de una tecnología transferible para la reproducción de otros hongos ACB.

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144. Zare, R.; Gams, W. y Culham, A. (2000). A revision of Verticillium sect. Prostrata I. Phylogenetic studies using ITS sequences. Nova Hedwigia, 71(3-4): 465-480.

Eventos y Publicaciones relacionadas con el tema

2. Villoch, A. y Montes de Oca, N. Análisis de las necesidades y beneficios de aplicación de sistemas de gestión de la calidad ven las producciones de bioplaguicidas. IV Seminario Científico Internacional de Sanidad Vegetal, Varadero, 2001.
3. Juan alemán y Montes de Oca, N. Situación actual y perspectivas del control de la calidad en las producciones masivas de artrópodos. IV Seminario Científico Internacional de Sanidad Vegetal, Varadero, 2001.
4. Atkins S.D., Hidalgo-Diaz, L., Clark, I.M., Morton, C.O., Montes de Oca, N., .Gray, P.A Kerry, B.R. Approaches for monitoring the release of Pochonia chlamydosporia var. catenulata, a biological control agent of root knot nematodes. Fourth International Congress of Nematology, Tenerife, Islas Canarias, 2002.
5. Montes de Oca, N. e Hidalgo, L. Identificación y Monitoreo de la cepa Vcc-108 de P. chlamydosporia var. catenulata.Taller de la ACTAF (2003).
6. Montes de Oca, N., Arévalos, J.; Peteira, B.; Puertas, A.; Acosta, N. y Hidalgo. Estudio de la estabilidad de la cepa P. chlamydosporia var. catenulata (Vcc-108). Taller de la ACTAF 2004.
7. Montes de Oca, N., Arévalo, J.; Peteira, B.; Puertas, A.; Acosta, N. y Hidalgo-Diaz. Estudio de la estabilidad de la cepa P. chlamydosporia var. catenulata (Vcc-108). IV Seminario Científico Internacional de Sanidad Vegetal, La habana, 2004.
8. Puertas A.; Hernández, M.A.; Montes de Oca, N., Peteira, B.; Miranda, I. e Hidalgo Díaz, L. Efectividad en campo de P. chlamydosporia var. catenulata (Vcc-108) agente de control biológico de nematodos formadores de agallas. IV Seminario Científico Internacional de Sanidad Vegetal, La Habana, 2004.
9. Montes de Oca, N., A. Villoch, Peteira B., Rodríguez, M.; Atkins S., Kerry, B. y o Hidalgo L. Assurance and Control Quality for the production of Pochonia chlamydosporia var. catenulata. XXXVI Reunión de la ONTA, México, 2004.

Publicaciones

2. Villoch, A. y Montes de Oca, N. (2003). Sistema de Gestión de la Calidad. Su utilidad en la industria de Biocontroles. Rev. Protección Veg. Vol. 18, No. 2 p.85-91.
3. Villoch, A. y Montes de Oca, N. (2003). Elaboración de una Guía de Buenas Practicas para la Producción de Biocontroles. Rev. Protección Veg. Vol. 18, No. 2 p.92-97.
4. Atkins, S.D.; Hidalgo-Díaz, L.; Clark, I.M.; Morton, C.O.; Montes de Oca, N.; Gray, P.A. y Kerry, B.R. (2003). Approaches for monitoring the release of Pochonia chlamydosporia var. catenulata, a biological control agent of root knot nematodes. Mycol. Res. 107 (2): 206-212.
5. Montes de Oca, N. y Hidalgo, L. (2004). Sistema de identificación de la cepa Vcc-108 P. chlamydosporia var. catenulata agente de control biológico de Meloidogyne spp. Rev. Protección Vegetal. En revisión.
6. García, L.; Bulnes, C.; Melchor, G.; Vega, E. Montes de Oca, N.; Hidalgo-Díaz, L. and Marrero, E. (2004). Safety of Pochonia chlamydosporia var. catenulata on acute oral and dermal Toxicity/ Pathogenicity evaluations in rats and rabbits. Veterinary and Human Toxicology, 46(5): 248-250.
7. García, L.; Melchor, G.; Montes de Oca, N. y Hidalgo-Díaz, L. (2004). Estudio de la irritación ocular y dérmica de Pochonia chlamydosporia var. catenulata. Rev. Toxicología., 21(1):103-107.
8. Hidalgo-Díaz, L.; Montes de Oca, N.; Correa, H.; Fraga, I. (2004). Commercial Production Technology of Pochonia chlamydosporia. Report Final, Work package 3. Partner 6, CENSA in II Annual Meeting MicoSPA-Project. No. ICA4-2001-10185.
9. Hidalgo, L.; Montes de Oca, N.; Correa, H. y Hernández, M.A. (2004). Manual para la investigación y desarrollo de un Bionematicida a partir de la cepa Vcc-108 de Pochonia clhamydosporia var. catenulata. OCIC. CENSA.

Datos del autor

Nivian Montes de Oca* PhD,

Doctor en Ciencias Agrícolas, Investigador Auxiliar de la Dirección de Calidad del Centro nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA). Carretera de Jamaica y autopista Nacional, Apto 10 San José de las lajas, La Habana, Cuba.

Jersys Arévalo,

Nerdys Acosta,

Alejandra Villoch PhD

Leopoldo Hidalgo PhD.