Citometría de flujo

La CMF es una técnica sencilla que se aplica en la rutina diaria de muchos laboratorios clínicos y de investigación, capaz de proporcionar resultados de forma rápida que pueden ser aplicables al diagnostico. Gracias a su gran especificidad es capaz de distinguir entre varias diferentes, y detectar una población celular en una muestra en la que predominan otras poblaciones celulares mayoritarias. Pero la principal característica de la CMF es que puede ofrecer información simultánea de varios parámetros de cada una de las células analizadas y la relación entre los parámetros de una célula y los de otra célula también analizada. Permite el análisis de dos parámetros de dispersión, SSC/FSC y tres de fluorescencia (en equipos con un solo láser), Fl1, Fl2 y Fl3, y de una cuarta fluorescencia en equipos con dos láseres. (www.citometriadeflujo.com)

VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA CITOMETRIA DE FLUJODebido a la necesidad de utilizar una suspensión de partículas (células, núcleos, cromosomas, etc), para ser leídos de una en una hace que se pierda información sobre la arquitectura de los tejidos que componen las células o de las propias células, así como la ineracción entre estas y el medio que las rodea (patrones nodulares o difusos de los linfomas). Frente a este inconveniente la CMF presenta múltiples ventajas frente al microscópio de fluorescencia y las técnicas citoquímicas, como: – Posibilidad de empleo de multiples frente a un solo marcaje de la citoquímica y la microscopia de fluorescencia. – Posibilidad de analizar un elevado número de partículas en un corto período de tiempo (5000 partículas/segundo). – Posibilidad de cuantificar la por medio de los canales medios de fluorescencia. – Mayor sensibilidad y objetividad que le permiten detectar enfermedad mínima residual y caracterizar poblaciones celulares poco abundantes en condiciones normales como los basófilos. – Posibilidad de analizar poblacionescelulares y epitopos celulares. – Permite almacenar informáticamente la información del análisis para poderla utilizar en cualquier momento y reanalizar análisis hechos con anterioridad. – Posibilidad de cuantificar las moléculas antigénicas presentes en un grupo celular. (www.citometriadeflujo.com)

ESTRUCTURA BÁSICA DE UN CITÓMETRO DE FLUJO

Esta compuesto por tres partes:

* SISTEMA FLUÍDRICO – Inyección de la muestra.

– Cámara de flujo. * SISTEMA OPTICO – Fuentes de luz. – Detectores

* SISTEMA ELECTRICO – Amplificador-convertidor. – Sistema informatico

SISTEMA FLUÍDRICO: Este sistema consta de dos fluídos, uno que contiene en suspension a la muestra y otro que lo envuelve a fin de darle estabilidad (sheath fluid). Las células deben pasar una a una por delante del haz del láser. Ambos fluídos (Solución fisiológica, PBS, aire) no se mezclan porque circulan a diferente presión.

SISTEMA ÓPTICO: Este sistema se compone de dos tipos de ópticas:
La óptica de excitación, compuesta de el láser y las lentes apra enfocar y dirigir el haz de luz; y
La óptica de lectura, compuesta por las lentes de recolección de luz emitida luego de la interacción entre el haz del láser y las partículas y el sistema de espejos y filtros para direccionar longitudes de onda específicas hacia los detectores correspondientes.
FILTROS OPTICOS: Son aquellos que seleccionan las longitudes de onda que deja pasar hacia el detector. Estos pueden ser:
DE INTERFERENCIA (Dicroicos que reflejan las long de onda no deseadas);
DE ABSORCION (absorben las long de onda no deseadas). De éstos hay tres tipos:
Filtros Band Pass : Dejan pasar un rango de longitudes de onda (Por ej: 620 – 640 nm)
Filtros Short Pass: Dejan pasar por debajo de una longitud de onda determinada ( Por ej: < 575 nm)
Filtros Long Pass: Dejan pasar por encima de una longitud de onda determinada (Por ej: > 520 nm)

SISTEMA ELECTRICO: El sistema electrónico convierte todo en señales digitales para almacenar en la computadora.

INFORMACION OBTENIDA POR CITOMETRIA DE FLUJO

Básicamente podemos obtener los siguientes datos:

Tamaño de la célula
Complejidad de la membrana celular
Con el uso de fluorocromos se puede deterctar hasta 3 colores con un mismo laser

Señales de dispersión: La dispersión resulta de la interacción de la luz con una partícula que produce un cambio de dirección (no de la longitud de onda) en todas las direcciones del espacio. Las características morfológicas que determinan la dispersión de la luz son fundamentalmente el tamaño celular, la membrana, el núcleo y el material granular del interior de la célula, llamado complejidad. En los Citómetros de Flujo se miden dos fracciones de dispersión: -La luz dispersada en ángulo cónico pequeño (0-10º) que casi coincide con la dirección de la luz incidente, llamada FSC (Forward Scatter). Es una medida proporcional al tamaño de la partícula que produce la dispersión. -La luz dispersada en ángulo recto llamada SSC (Side Scatter). Es proporcional a la complejidad de la estructura interna de la partícula. (www.citometriadeflujo.com)

Señales de Fluorescencia: Un fluorocromo es una molécula química que absorbe luz a una determinada longitud de onda (energía) y emite a una longitud superior (menor energía). El espectro de absorción o excitación es el rango sobre el que un fluorocromo absorbe luz, y el espectro de emisión es el rango sobre el que un fluorocromo emite luz. Cuando un fluorocromo interacciona con la luz de excitación procedente del láser emite energía radiante. Debido a que parte de la energía se utiliza para la absorción, la luz emitida es de menor energía que la luz de excitación, es decir la longitud de onda emitida es mayor. La diferencia entre la longitud de onda de absorción y emisión se denomina Stokes shiff. Los citómetros de flujo permiten detectar señales de fluorescencia procedentes de complejos Antigeno/Anticuerpo marcados con un fluorocromo y situados en una célula, siendo la cantidad de señal de fluorescencia emitida igual a la proporción de la cantidad de componentes fluorescentes de la partícula. (www.citometriadeflujo.com)

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De forma esquemática, las células teñidas entran en la cámara de flujo de una en una y, al pasar por delante de un haz de luz de láser, emiten una luz fluorescente y dispersada, que es separada de acuerdo a su longitud de onda por apropiados filtros y espejos. Estas señales luminosas son recogidas por detectores y la información se integra y analiza adecuadamente por un sistema informático. (http://www.opolanco.es/Apat/Boletin2/CITOFLUJO.htm)

MARIANA PUCCIARELLI