(Gp:) Purificación de PMN provenientes de Ficoll-Hypaque (Gp:) Por sedimentación sobre dextran 6 % (Gp:) Lisis con H2O (1’) Llevar a isotonicidad (Gp:) PMN + GR * (Gp:) GR (Gp:) Dextran (Gp:) PMN + GR + SF (Gp:) Agitación por inversión y sedimentación por 30’
El dextran es un polisacárido complejo y ramificado formado por muchas moléculas de glucosa unidades en cadenas de longitud variable (de 10 a 150 kDa). La cadena consiste en uniones glucosídicas a1->6 entre moléculas de glucosa, mientras que las ramificaciones empiezan en uniones a1->4 (en algunos casos también en uniones a1->2 y a1->3). El dextrano es sintetizado a partir de la sacarosa por ciertas bacterias ácido-lácticas( Leuconostoc mesenteroides y Streptococcus mutans).
Separación de células sanguíneas humanas por centrifugación en gradiente de Percoll Cuando la densidad del medio y de las células son iguales, entonces v = 0 y la célula flota en una posición de equilibrio. (Gp:) Mononucleares (linfocitos) (Gp:) GR (Gp:) PMN (Gp:) 70 % (1083) (Gp:) 60 % (1077) (Gp:) 50 % (1065) (Gp:) Plasma Monocitos, NK
Gradiente de Percoll (50-70 %): Buena recuperación y pureza mayor al 90 % Percoll. Se trata de una suspensión de partículas (5.15 nm) de ácido silícico revestidas de un derivado de polivinilo (polivinilpirrolidona, PVP) que presenta baja viscosidad a densidades altas, no afecta prácticamente a la presión osmótica del medio y es estable a pH comprendidos entre 5 y 10. Es soluble en solución acuosa y estable en ellas siempre que no haya aniones bivalentes (sulfato), especialmente a bajos pH. El compuesto puede ser utilizado para centrifugaciones zonales, preformando gradientes, o bien para centrifugación isopícnica, ya que la centrifugación de percoll en rotores angulares durante 20-30 minutos y 20.000-100.000g produce un ligero gradiente, independientemente de la densidad inicial del percoll.
Métodos basados en adherencia 3 categorías: 1- Adherencia activa: Requiere del metabolismo celular y es temperatura dependiente (ej: macrófagos, polimorfonucleares) 2- Adherencia física: Se puede realizar a 4 °C o a 37 °C (ej: subsets de células B) 3- Adherencia de células muertas o dañadas Sustancias empleadas: Sephadex G10: Quedan retenidas las células adherentes. La separación se basa en adherencia y tamaño. Polvo de hierro (Carbonyl iron powder): Las células que fagocitan o se adhieren a las partículas de hierro, son removidas con un imán. (ej: Remoción de linfocitos B) Lana de nylon: Se utiliza para obtener células T libres de células B. El rendimiento es bajo (15 a 25 %). Puede haber retención diferencial de subpoblaciones T. Adherencia a superficies de vidrio o plástico
(Gp:) Adherencia a lana de nylon (Gp:) Rendimiento bajo (15-25 %) Alta pureza. (Gp:) Métodos basados en adherencia (Gp:) Adherencia a superficies de vidrio o plástico (Gp:) * Purificación de macrófagos (células adherentes) * Separación por agentes químicos (quelante de calcio, EDTA o tripsina) o por rastrillado. (Gp:) * Purificación de linfocitos T
Métodos basados en afinidad (Interacción receptor-ligando) *Rosetas *Columnas con anticuerpos *Panning: superficies plásticas recubiertas con anticuerpo *Beads magnéticas *Aglutinina de maní: interacciona con residuos D-galactosa de timocitos inmaduros, aglutinando las células (las células maduras presentan éstos residuos enmascarados por ácido siálico. *Aglutinina de soja: aglutina células B pero no células T. *FACS
(Gp:) Monocitos + LB (Gp:) Métodos basados en afinidad (Interacción receptor-ligando) (Gp:) Rosetas espontáneas (Gp:) Ficoll-Hypaque (Gp:) GRc (Gp:) GRc (Gp:) GRc (Gp:) GRc (Gp:) GRc (Gp:) LT (Gp:) Roseta (Gp:) GRc (Gp:) CD 2 (Gp:) Rosetas T (Gp:) LT (humanos) (Gp:) A partir de interfase de Ficoll- Hypaque
Métodos basados en afinidad
(Gp:) Panning (Gp:) Utilización de pequeñas beads recubiertas con anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a los linfocitos T o B. Una vez hecha la unión las células se extraen con la ayuda de un separador magnético. La pureza es excelente. Se trabaja a temperatura ambiente (Gp:) Beads magnéticas (Gp:) Y (Gp:) Y (Gp:) Y (Gp:) Y (Gp:) Y (Gp:) Y (Gp:) Y (Gp:) Y (Gp:) Y (Gp:) Y (Gp:) Y (Gp:) superficies plásticas recubiertas con anticuerpos (Gp:) CD 19 (Linfocito B) (Gp:) CD 3 (Linfocito T) (Gp:) Selección positiva Selección negativa
Técnicas inmunomagnéticas
Receptor de la superficie celular que se combina con un ligando (basado en la especificidad de la interacción) Antisuero + complemento: Eliminación de una subpoblación que lleva un antígeno de membrana específico.
Método basado en filtración por columna de bolitas de vidrio 53 a 65 µ de diámetro Las células más grandes se retrasan con respecto a las más pequeñas. El vidrio debe estar siliconado
Metodo basado en carga eléctrica neta En roedores hay una distribución bimodal de movilidades correspondiendo a células B y T. En humanos esa distribución no se puede correlacionar con las poblaciones B y T Otros métodos de separación
Métodos basados en la separación funcional por inactivación de células proliferantes
1- Pulso de timidina marcada con radioisótopos Linfocitos expuestos a Ag o mitógenos se dividen y la timidina se incorpora al ADN La desintegración radioactiva mata las células proliferantes. (Reacciones mixtas de linfocitos, respuestas citotóxicas mediadas por células). (Gp:) La timidina se incorpora al ADN celular
X
2- Pulso de 5-Br-2-Deoxiuridina (BUdR) Se incorpora al ADN en células en división como análogo de la timidina. Cuando se activa con luz UV, causa el daño del ADN.
3- Mitomicina C Causa cross-linking del ADN y las funciones que requieren división celular son abolidas 4- Irradiación Rayos X, Cobalto (60Co), Cesio (137Cs), rayos gamma. X
| Página siguiente |