Los carbohidratos representan una de las clases más comunes de compuestos orgánicos presentes en la tierra y su análisis y purificación resulta ser de extrema importancia para los investigadores bioquímicos. En los sistemas bioquímicos, los carbohidratos desempeñan diversas funciones como por ejemplo: son esenciales en el metabolismo de las plantas verdes, desempeñando un importante papel en la utilización del CO2. Representan las últimas fuentes de carbono y de energía en los organismos no-fotosintéticos y pueden ser estructuralmente necesarios, como en el caso de la celulosa de las plantas ó de la quitina, como constituyente principal del caparazón de varios organismos. Otros tipos de carbohidratos juegan papeles diversos a la manera de: lubricantes, factores de reconocimiento celular, determinantes grupo sanguíneos y como anticongelantes celulares. Las glicoproteínas (proteínas unidas a residuos de carbohidratos) por su parte, actúan como enzimas, anticuerpos, hormonas y receptores glicoconjugados en la relación huésped-patógenos. En éste caso, los carbohidratos pueden participar en la conformación estructural, metabolismo, tiempo de vida media y en el aporte celular de las proteínas. Así también, eventos como la diferenciación y el reconocimiento celular y la actividad hormonal; pueden verse afectados por causa de las porciones glicánicas (carbohidratos) que conforman a las glicoproteínas.1Los carbohidratos son componentes integrales de moléculas amplias y complejas tales que las glicoproteínas, glicoesfingolípidos y de un diverso número de metabolitos secundarios de origen animal y vegetal.
Los carbohidratos pueden unirse mediante derivatización natural o por conjugación a una amplia variedad de compuestos a través de múltiples maneras de naturaleza química o enzimática. El análisis de los carbohidratos puede dividirse en 2 áreas: mediante los métodos basados en la cromatografía y de aquéllos que emplean otras técnicas diversas. Los primeros incluyen a los procedimientos inmunológicos como la inmunoprecipitación y la inmunofluorescencia a pesar de no ser específicamente enzimáticos, pero en base a su etiología biológica.
Dos tipos de análisis enzimáticos son comunes: el específico para monosacáridos y, el específico para la hidrólisis de oligosacáridos de cadena larga.2 Dichos métodos son extremadamente resolutivos pero se ven limitados por las interferencias derivadas de los contaminantes presentes en las soluciones de prueba, e incluso por la presencia de otros azúcares, sales y metales. Además, tanto la pureza como el origen de las enzimas, resultan ser críticos en la determinación de los carbohidratos. La actividad y especificidad de las glicosidasas aisladas de diferentes fuentes, puede variar ampliamente. De la misma forma, pueden surgir confusiones en la liberación de más de un residuo monosacarídico después de la hidrólisis de oligosacáridos ramificados mediante una sola exoglicosidasa. La falta de una hidrólisis puede no necesariamente indicar la ausencia de alguna unidad monosacarídica particularmente no-reductora; ya que el grado de liberación dependen tanto de la longitud como del arreglo secuencial de las unidades sacarídicas vecinas que conforman a la cadena oligosacarídica.
Aún más, se debe considerar también, de que existe la posibilidad de que un monosacárido dado se encuentre presente en la forma furanosa en lugar de la piranosa, así como la presencia de contaminantes inhibidores de glicosidasas.
La fuerte especificidad de los métodos enzimáticos, resulta ser igualmente contraproducente, dado que cada uno de los carbohidratos, requieren tanto de diferentes condiciones para su análisis, como de diferentes series de enzimas. Mientras que los métodos enzimáticos han sido los seleccionados para algunos carbohidratos, particularmente la glucosa; los métodos cromatográficos han sido de gran valía al bioquímico. El análisis cromatográfico de los carbohidratos, así como el de cualquier otro analito; puede dividirse en 2 distintas áreas: la separación y la detección. La confusión se puede presentar aquí, debido al hecho de que los carbohidratos hidrosolubles, fuertemente polares y no volátiles; no son separados con facilidad por alguno de los métodos de rutina disponibles. Dado que no son cromofóricos, no logran ser detectados mediante la espectroscopia de absorción. La derivatización de éstos, de manera a favorecer sus características cromatográficas y de absorbancia; pueden sin embargo, dar lugar a la formación de múltiples picos para cada analito, como resultado de una derivatización incompleta. Numerosas técnicas de separación de los carbohidratos se han desarrollado a lo largo de los años. La cromatografía en papel, aunque es extremadamente barata; requiere de varias horas e inclusive días para la separación de tan solo simples monosacáridos y si se trata de oligosacáridos, éstas separaciones resultan a menudo imposibles.3
Varias técnicas de cromatografía en capa fina y de alta resolución de la capa fina, han logrado desarrollarse.4Mientras que una selección adecuada de la fase estacionaria, fase móvil y ocasionalmente una derivatización precromatográfica pueden asegurar la separación de varios carbohidratos; una limitada resolución proporcionada por el número de platos de la capa fina, reduce el número de los posibles analitos que pueden ser separados. Los carbohidratos presentes como mono o como oligosacáridos, deben ser derivatizados de manera a poder analizarlos mediante las técnicas de cromatografía de gases. Diversas técnicas de derivatización han sido desarrolladas e incluyen: la formación de alquil-éteres o alquil-ésteres, así como una trimetil-sililación.5En cualquiera de los casos antes mencionados, las muestras deben someterse a un pretratamiento, que a menudo incluye una remoción de proteínas y sales, antes de la derivatización.
A menudo. el método de detección empleado para la cromatografía de gases, como por ejemplo la ionización de llama o flama; tiende a ser destructivo y en el mejor de los casos, el trabajo preparativo requiere de reactivos de derivatización tóxicos, caros o químicamente lábiles. Aún más, los grandes oligosacáridos aún derivatizados, pueden sufrir una descomposición dentro del cromatógrafo. En el caso de los monosacáridos, la derivatización puede ser incompleta y dar lugar a la formación de múltiples picos por cada analito. La facilidad con la que se ha logrado establecer una interfase entre la cromatografía de gases y la espectrometría de masas; parece resultar muy útil en muchos de los casos. Cantidades significativas de datos estructurales pueden ser obtenidas cuando varios carbohidratos derivados son analizados.6Entre otras aplicaciones recientes, podemos mencionar el de la separación de carbohidratos sialilados, mediante la cromatografía por fluidos supercríticos. Dicho método promete avances pero al igual que la cromatografía de gases, se requiere que los carbohidratos sean derivatizados. Por otro lado, dado que se emplean bajas temperaturas, se reducen las posibilidades de una formación de artefactos inducidos térmicamente.
En el caso de las técnicas de cromatografía líquida en columna abierta, la de la permeación en gel ha permitido la obtención de mejores resultados.7Otras técnicas a bajas presiones incluyen una fase normal y una cromatografía de afinidad con lectinas inmovilizadas.8Mientras que algunos carbohidratos son iónicos de manera natural (azúcares aminados, ácidos urónicos, carbohidratos complejos sialilados, carbohidratos fosforilados, etc.) y pueden por lo tanto ser naturalmente separados por intercambio iónico; la adición de borato al eluante para el análisis de los carbohidratos neutros, da lugar a la formación de complejos borato-carbohidratos aniónicos que de igual manera pueden ser separados por intercambio iónico.9Los carbohidratos muy polares pueden ser también separados por métodos en fase normal y bajo diferentes substratos que incluyen: la hidroxiapatita, celulosa microcristalina, sílica y soportes de mezclas de carbón activado.
Los carbohidratos pueden ser separados tanto en su forma natural no derivatizada o en sus formas químicas -acil y –alquil. Actualmente, la cromatografía líquida a alta presión o resolución incluye técnicas como: la permeación en gel, materiales de intercambio catiónico empacados con metales, fases de sílica aminopropilo y de fase reversa. Para el análisis completo de una mezcla compleja de oligosacáridos derivados de glicoproteínas, se requiere emplear una técnica de 2 columnas. El fraccionamiento por tamaños mediante una columna aminopropil, es seguida por una resolución de las especies estructuralmente distintas dentro de cada fracción, utilizando una columna de fase reversa.10La fase reversa ha permitido la separación de carbohidratos derivatizados mediante columnas C-18. Los derivados más comunes empleados en cromatografía de líquidos, son: los benzoatos, alquil-éteres y acetatos.11Las técnicas electroforéticas también pueden ser incluídas como del tipo cromatográfico. Se han usado en la separación de carbohidratos de manera preparativa y analítica. En la mayoría de los casos, son los glicopéptidos preparados mediante hidrólisis enzimáticas o químicas; los que logran ser separados de manera electroforética, aunque también se les puede separar por cromatografía líquida a altas resoluciones o presiones.
Diversas técnicas han sido empleadas en la detección de los carbohidratos después de la separación cromatográfica. Aquí se incluyen las revelaciones con sprays o inmersiones de tiras de papel en paltos de capa fina conteniendo diversos reactivos de coloración. Aunque se trata de métodos sensitivos, resulta muy difícil realizar un análisis cuantitativo. Dentro de los sprays cromogénicos se mencionan: el ácido tiobarbitúrico para la determinación de ácidos siálicos; el orcinol-ácido sulfúrico para determinar galactosa; antrona para hexosas; carbazol para ácidos urónicos; el resorcinol para residuos de ácidos siálicos unidos, y otros generales y específicos. Los métodos de detección basados en reacciones de unión enzimática, también han sido empleados y como ejemplo, se menciona el uso de la galactosa-oxidasa para determinar galactosa. Otra técnica fuera de línea y que permite monitorear la radioactividad presente en carbohidratos marcados presentes en muestras colectadas, es la del centelleo líquido. En gases, además de la ionización de llama, se tienen otros detectores como el de Nitrógeno-Fósforo que determinan carbohidratos amino derivatizados; mientras que el detector de captura de electrones, permite la determinación de muestras derivatizadas con residuos halogenados o que contienen el grupo arilo. Muchos carbohidratos exhiben actividad óptica, pero el problema que se presenta es que algunos desvían la luz hacia la izquierda (levógiros), otros hacia la derecha (dextrógiros) o son inactivos. En líquidos, los métodos de detección son las bajas longitudes de onda ultravioletas (190 a 210 nm)12 y el índice de refracción13 que es un método más bien no selectivo. La adición de cualquier soluto y el cambio mínimo de la temperatura, afectan éstos índices por lo que se dificulta su empleo.
Dionex (Sunnyvale, Calif.) ha recientemente introducido al mercado las series BioLCTM tanto para sistemas de separación como de detección. Mientras que tanto la coulombimetría como la amperometría, parecen ofrecer limitados resultados en el análisis de los carbohidratos: una técnica reciente "la pulsación amperométrica" parece brindar mejores resultados.14El detector de pulsación amperométrica logra detectar carbohidratos no reductores (alditoles y glicósidos) con la misma sensitividad para los reductores. La combinación de resinas peliculares de intercambio aniónico con una detección pulso-amperométrica, parecen ofrecer hoy en día, el más rápido, selectivo, sencillo, sensitivo y el mejor método de análisis de los carbohidratos.15
Referencias
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Autor:
ºMauricio Alfredo Ondarza Benéitez
ºUniversidad Autónoma de Tamaulipas. Unidad Académica Multidisciplinaria Reynosa-Rodhe. Ingeniería Ambiental. Carretera a San Fernando-cruce con canal Rodhe. Col. Arco Iris. Reynosa, Tamaulipas.