Dunaniella Viridis

Indice1. Introducción 2. Materiales y métodos 3. Resultados 4. Conclusiones 5. Bibliografía

1. Introducción

Dunaniella VIRIDIS,es un alga halotolerante ,flagelada , perteneciente al reino eucariota y a la familia Clamidaceae ,la cual, vive en lagunass saladas(en nuestro caso) , en los que muchas veces es la única microalga presente en su medio. (http://www.terra.es/personal2/naturenotes/dbiologia/biologia_extremofilos.htm)<1>. Los lagos salinos son generalmente someros, por lo que el viento puede provocar en ellos turbulencia que mezcla en forma eficiente todo el volumen acuático Por lo anterior, es muy probable que algunas comunidades acuáticas vean disminuída su diversidad biológica más como una respuesta a la homogeneidad del hábitat . La reducción de la biodiversidad en lagos salinos puede llegar a ser tan drástica, especialmente en los hipersalinos, que ésta puede estar limitada a un productor primario, halotolerante que como un estrés fisiológico inducido por la salinidad. El papel ecológico de los lagos salinos como sitio de refugio, alimentación, reproducción y crianza de multitud de aves migratorias es innegable. La pérdida de lagos salinos pone en peligro la viabilidad de estas especies de aves. http://www.conabio.gob.mx/biodiversitas/lagos.htm<2>.Este es el caso del flamenco común (Phoenicopterus ruber roseus) Los excrementos de esos mismos flamencos al caer al agua de los lagos proporcionan un campo de cultivo fenomenal para el desarrollo de Dunaliella En nuestro csao,fue extraída de la Laguna de Fuente de Piedra en la provincia de Málaga(UTM:30SUG4309);la cual es uno de los mayores complejos endorreicos de España(MONTES Y MARTINO.1987;LINARES,1990).<6>. Nuestro objetivo será el estudio de la influencia de las composiciones de fosfato y nitrato en el crecimento del microalga Dunaliella viridis; Hay que señalar que ausencia de nitratos en el medio, el crecimiento es casi despreciable, aunque el contenido en ß-caroteno alcanza un 8% del peso seco en 4 días. (http://www.cartuja.csic.es/SEFV99/abstracts/biotecnologia/p.7-33.htm)<3>

En respuesta al las altas concentraciones de solutos en el medio,Sintetiza altas concentraciones de glicerol intracelular 7 M (56%) como soluto compatible  para mantener el balance osmótico de lo contrario sufriría fenómenos de ósmoticos no deseables para su desarrollo (http://www.terra.es/personal2/naturenotes/dbiologia/biologia_extremofilos.htm) <4> En el siguiente trabajo se intentará demostrar que Dunaliella salina no sufre cambios significativos ante las concentraciones de nitrogeno y fosfato que se han suministrado para dicho trabajo

2. Materiales y métodos

Actividad Nº1: Preparación De Medios De Cultivo E Inóculación De Dunaliella Viridis En Dichos Medios Materiales:

• -sales de nitrato purificadas sólIdas
• -sales de fosfato purificadas ´sólidas
• -matraces de 5E3L
• -Dunaliella viridis procedente de Laguna de Fuente de Piedra(UTM:30SUG4309)

Métodos: –A–Dilución de dichas sales en las siguientes concentraciones: 1-Alto nitrato(5mM)+alto fosfato(0.26mM) 2-Alto nitrato(5mM)+bajo fosfato(0.052mM) 3-Bajo nitrato(1mM)+alto fosfato(0.26mM) 4-Bajo nitrato(1mM)+bajo fosfato(0.052mM) –B—Inoculación en los diferentes medios de Dunaliella viridis –C—Los cultivos se mantendrán en agitación permanente,bajo lus continua de 150 micromoles por metro cuadrado y segundo ;a una temperatura de 25 grados centígrados

Actividad Nº2: Medida De La Densidad Celular Materiales:

• -viales eppendorf
• -microscopio
• -lugol
• -cámara cuentaglobulos
• -cubreobjetos

Método: Conteo por microscopio en camara cuentaglobulos ;para lo cual se habra teñido antes con lugol .dicho compuesto pone de manifiesto el pirenoide del microalga El valor medio se multiplica por 160000,lo que nos dará una densidad de nº de cállulas por ml.

Actividad nº3: NEFELOMETRÍA(medidad de la absorbancia a 750nm): Materiales:

• -Espectrofotómetro
• -cubetas
• -microalga

Método: Tomar cultico in vivo,añadir al espectrofotómetro 1-2ml y medir absorbacia a 750nm Construir gráfica que enfrenmte densidad celular y datos ibtenidos Ver si es la misma para todos los cultivos

Actividad Nº4: MEDIDA DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS Extracción de acetona a partir de pellets y medidad espectrofotométrica Materiales:

• -Espectrofotómetro
• -Centrífuga de mesa
• -tubos
• -acetona

Método de extracción y medida *1-tomar 5ml de muestra y centrifugar durante 5min *2guardar sobrenadante para medir fosfato con método verde malaquita *3resuspender el pellet en 4ml de acetona para extraer pigmentos *4mezclar y enrasar a 5ml con H2O destilada *5centrifugar 1min *6medir la absorbancia del sobrenadante resultante -750nm turbidez -664nm máximo de absorción de la clorofila A -480nm máximo de absorción de pigmentos carotenoides *7cálculos: -para clorofila A:multiplicar resultados por factor de 10,3(mg/ml) -para carotenoides:multiplicar por factor de 10(mg/ml)

Actividad Nº5: MEDIDAS DE NITRATOS,NITRITOS Y AMONIO Se filtran 10ml de cultivo y se congelan para psterior análisis

Actividad Nº6: MEDIDA DE FOISFATO: Materiales:

• -filtros GF/C
• -tubos
• -reactivo verde malaquirta
• -espectrofotómetro
• -soluciones conocidas de fosfato de 2.5,5,10,15,25 micromoles por litro

Método:

• -usar sobrenadanbte de la extracción de pigmentos
• -_filtrarlo por GF/C
• -mezclar en un tubo 2ml de muestra y 4 de verde malaquita
• -esperar 5min
• -medir absorbacia a 660nm(el blanco será el reactivo)
• –hacer lo mismo con las concentraciones conocidas y construir recta patrón

Actividad Nº6: MEDIDA DE Ph: Materiales: -Electrodo Método: -se miden los cultivos con el electrodo

Actividad Nº7: MEDIDAD DE LAS TASAS DE FOTYOSÍNTESIS Y RESPIRACIÓN RESPECTIVAMENTE: Método: -Incubaciones de unos 10 min en luz y oscuridad midiendo el oxígeno inicial y el final

Cálculos: OXÍGENO INICIAL-OXÍGENO FINAL=X(mg/Ml) X(mgO2/L*0.125L/Ycélulas(en 125mL incubados /10min Explicación:0.125mL es el volumen de cultivo introducido en el mnatraz para hacer las incubaciones. Se multiplica por el número de células conocido que hay en un .mL,y se divide por 10 que es el tiempo total prar tener el calculo en unidades por min Se puede transformar luego a picogramos hora multiplicandp por 60

3. Resultados

Observaciones: El día 1 es en realidad el 3º de cultivo(Carlos Jiménez UJA) Aunque se realizaron dos inoculaciones de Dunaliella viridis en fechas diferentes consecutivas; sólo se muestra el inóculo número uno ,correspondiente al periodo comprendido entre los días 29 de Octubre de 2002 y 15 de Noviembre del mismo año; ya que el número dos presentaba más errores en las toma y realización de muestras Las gráficas aquí mostradas fueron realizadas con Microsoft Excel, así como con Microsoft word el texto. Las zonas que aparecen en las gráficas sin líneas corresponden a datos omitidos por una toma de ficiente de los datos

Gráficas:

• K para n+p+=16021333 y r=0.15
• K para n+p-=15000000 y r=0.13
• K para n-p+=13362666 y r =0.0.12
• K para n-p-=7535466 y r=0.13

TABLAS:

R de crecimiento de cultivos

Tratamiento mediante ANOVA NO CONCLUYENTE

Respiración

Fotosíntesis:

Cálculos:

Análisis de la varianza para el crecimiento

Discusiones: En resultado estadístico para las columnas(nitratos) F<Feperimental ;luego acepto que existe influencia de los tratamientos de nitrato en el crecimiento. Por el contrario la muestra(fosfatos),no influye en el crecimiento. Esto puede ser debido a que existe una cantidad de fosfatos lo suficientemente significativa como para que no sea el elemento limitante del crecimiento en la muestra. Cabe hacer las siguientes observaciones: **El día 15 del tratamiento se ve un decaimiento generalizado del crecimiento, el cual coincide con un incremento en la producción de carotenos ;lo cual verifica de forma no estadística, la afirmación de<5>,en la que se comenta el aumewnto de de lam producción de carotenos por prte del material biológico que hemos estudiado,cuando la concentración de nitratos baja. Esto último ocurre de manera más acentuada cuando el nitrato es el único componente deficitario.Esto se puede observar en la gráfica adjunta en la sección resultados. No obstante hacría que continuar,con la observación del inóculo para obtener más datos. Como elucubración sobre este fenómeno se podría decir que el alga puduiera que produjera una respuesta generalizada ante cualquier tipo de stress y que la producción de carotenoides fuera una de estas respuestas. Estea producción de carotenos se observa sobre todo( nivel comparativo entre la s gráficas)cuando el nitrato empieza a escasear y todavía el fosfato no ha caído demasiado. **Cuando aumenta el ion amonio en grandes cantidades en un sistema, es indicativo de que se está desarrollando una producción regenerada(Jaime Rodríguez;Ecología,1999;204)<5>.En nuestrpo sistema se puede observar que los cuatro medios hasta el tercer día no no se separan,gráficamente hablando demasiado en sus concentraciones de NH+4,se podría decir que hasta este momnento no existe producción regenerada. Este descenso coincide con una suave suvida generalizada en los 4 medios del nitrio ,el cual es un intermediario en la asimilación del nitrogeno por parte de Dunaliella. Dicha producción esta catalizada por la nitrato reductasa que es la enzima que controla el procenso de asimilacón(Jaime Rodrigue;Ecología;1999;pp148). En nuestro cultivo N-P+ se puede ver como la bajada de nitratos es más acentuada y esto puede ser,a parte de por ,una ,rápida asimilación,pórquela haber suficiente fosfato en el medio las reacciónes de fosforilación-defosforilación no están limitadas,por lo que se pueden producir más fácilmente la fijación de nitratatos ya que probablemente la nitrato reductasa encuentre más fácilmente el ATP necesario para su funcionamiento. Esto también sería extrapòlable a los procesos anabólicos necesarios para la formación de enzimas,entre ellas la anteriormente mencionada. Por lo cual;si no hay suficiente fosfato el nitrato se asimilará más lentamente por la falta de enzimas y energía química que son necesarias..ÉSTE PUDIERA SER el motivo por el cual Dunaliella asimila más lentamente el nitrato en los medios faltos de fosfato

4. Conclusiones

1-dunaliella viridis no es afectada significativamente por las concentraciones de fosfato utilizadas en el ensayo. 2-Dunaliella viridis es afectada significativamente por las concentraciones de nitrato usadas en el ensayo. 3-posible sobreproducción de carotenoides después del agotamiento de nutrientes.Para comprobación habría que continuar más tiem`po el ensayo. 4-Posibles beneficios económicos por producción de carotenoides en condiciones de de stress por bajs [nitrato] 5-Posiblemente al estar adaptada a medios pobres en fosfato optimice sus recursos lo que le hace no tenerlo como recurso limitante en el medio. 6-si el recurso limitante es el nitrógeno significa que probablemente este abunde en su medio por eso no ptimizaría su uso tanto como el fosfato

5. Bibliografía

<2> ( Alcocer, J. y E. Escobar. 1992. La producción primaria en aguas athalasohalinas. Rev. Soc. Mex. Hist. Nat. 43: 101-108. Alcocer, J. y W.D. Williams. 1993. Lagos salinos mexicanos. Pp. 849-865. In: Biodiversidad marina y costera de México. S.I. Salazar y N.E. Gonzáñez (eds.). CONABIO y CIQRO. México. 865pp. )(2) <3> <4> Avron, M. & Ben-Amotz, A. (1979). Metabolic Adaptation of the Alga Dunaliella to low water activity. In Strategies of Microbial Life in Extreme Environments, Berlin: Dahlem Konferenzen, 1978. (Ed. M. Shilo). . pp. 83-91.)>3> <5> Jaime Rodríguez:EOLOGÍA;Ediciones Pirámide 1999 <6>Montes C. Y P.martino(1987).Las aguas salinas españolas pp95-145 en Bases científicas para la protección de humedales de España.Reqal academia de ciencias exactas,Físicas y naturales.Madrid Palabras Clave: Dunaliella Viridis,Halófitos,Halotolerante,Carotenoide

Autor:

Antonio García Blesa