Estudios fitoquímicos preliminares del Protium cubense (página 2)

La zona de inhibición es el área que rodea al disco donde el crecimiento ha sido completamente inhibido, sin embargo con las cepas de referencia, la zona puede aparecer invadida aunque se define claramente. No se debe tener en cuenta esta invasión.

Existe un sistema de lectura directa, muy fácil de reproducir, que funde la lectura e interpretación en un solo paso: Se confeccionan laminas circulares transparente con círculos concéntricos cuyos diámetros delimitan zonas que se corresponden con las categorías " Sensible", "Intermedio" y "Resistente" que aparecen en la tabla de interpretación de Bauer- Kirby. Basta con hacer coincidir el disco cuyo halo de inhibición se desee leer con él círculo central de lámina de lectura. El límite de la zona de inhibición, caerá en una de las tres zonas concéntricas. El halo de inhibición se midió con una Regla VD y se expresó en mm. (Ericson, A.M; Sdigmon, S. J, 1971)

Concentración de los extractos empleados

Para los ensayos in vitro se emplearon tres niveles de concentración bien diferenciados, del extracto de la planta: extracto puro al 100%, 50% y 1%.

Tratamiento estadístico.

El tratamiento estadístico se realizó empleando el paquete Statistic para Windows, versión 6.0, se empleó el análisis de varianza paramétrico clásico del halo de inhibición respecto a 3 grupos con 3 niveles de concentraciones y un grupo control positivo representado por el halo de inhibición de 3 antibiótico modelo. Este análisis se complemento con un test de newman-keuls, (Stell y Torre, 1992) para la comparación múltiple de medias y fue complementado con un test de Scheffee (J, Sieguel, 1987).

Materiales

Para el montaje del experimento se utilizaron los siguientes materiales:

• Incubadora bacteriológica a 37° C

• Nevera de 2 a 8 ° C

• Hisopo

• Regla VD: 1 mm

• Solución patrón de turbiedad Mc Farland

• Agar de Muller-Hinton

• Caldo de cultivo Muller-Hinton

• Tubos

• Mechero

• Placa petri

• pinzas

Resultados y Discusión

La selección de esta planta se realizó atendiendo al amplio uso popular, a la disponibilidad de la misma y su carácter endémico de Cuba y de la Región Oriental. Se seleccionaron cepas de microorganismos de referencias ATCC para lograr resultados fiables y comparables con los obtenidos en otros estudios y reportados en la literatura. Se tuvo en cuenta además que estas cepas son las más comunes que se presentan en las enfermedades causadas a enfermos animales y humanos.

Tabla # 1. Resultados del control de calidad de la tintura al 20% del Protium cubense (Copal Verdadero)

Como se observa en la tabla # 1 la tintura al 20% tanto de la corteza y las hojas del Protium cubense, están en los rangos de calidad que establecen las normas para el uso de las formulaciones, tiene un valor de los sólidos totales superior a 3.5 lo que indica una concentración adecuada de principios activos. La densidad está por encima de 0,90 g/ml y el pH se estabilizó por debajo de 7 lo que indica que son soluciones ligeramente ácidas hecho este que unido al medio alcohólico en que se preparan permite su estabilización y conservación por períodos de tiempos largos.

Esto fue corroborado por el análisis de calidad de las muestras testigos, después de un período de seis meses de reposo sin observarse además la formación de sólidos. Se comprobó que los parámetros de calidad mostrados en la tabla # 1 mantienen sus valores constantes indicando, que la composición y la calidad de las mismas no varían durante este período, lo que se considera como garantía de calidad para las condiciones del experimento.

Composición fitoquímica de los extractos

La composición de los extractos empleados se realizó según la técnica reportada por (Payo, Sandoval y Peña, 2002) cuyos resultados se muestran a continuación.

Tabla # 2. Resultados del análisis fitoquímico de la tintura al 20% y los extractos secos.

Como se observa en la tabla # 2 tanto la corteza como las hojas del Protium cubense son muy ricas en metabolitos, destacándose en las hojas un alto contenido de flavonoides, antocianidinas, quinonas y cumarinas y en la corteza cumarinas, azucares reductores, flavonoides y quinonas.

Es importante señalar que el estudio fitoquímico se realizó a la tintura y el extracto seco de ambas partes de la planta demostrándose que la composición de estos se mantiene semejante a la tintura lo cual garantiza que una vez retirado el solvente a la formulación, empleando métodos a baja temperatura como es la roto evaporación no descompone los metabolitos y por tanto las propiedades farmacológicas se deben mantener de forma inalteradas, esto garantiza que los extractos secos y las formulaciones que se preparen a partir de estos tienen la misma composición, es conocida la dependencia que existe entre composición química y propiedades biológicas.

Debe señalarse que tanto en la corteza como en las hojas de la planta no se detectó la presencia de alcaloide a pesar de que las muestras se trabajaron en condiciones de temperaturas que no excedió los 45 ºC, por lo que se puede afirmar la ausencia de este tipo de metabolito en las muestras.

Experimentos in vitro

Las formulaciones obtenidas y validadas se sometieron a experimentación para comprobar la eficacia frente a bacterias y hongos de referencias con el empleo de modelos experimentales validados.

Debe destacarse que en los experimentos realizados se utilizaron los extractos secos obtenidos a partir de la tintura para evitar los efectos de enmascaramiento que pueden producir los solventes y de esta forma poder determinar el efecto verdadero de los extractos sobre las bacterias y hongos estudiados.

Se emplearon tres niveles de concentración de los extractos para cada microorganismo y se empleó el protocolo de ensayos descrito para el desarrollo de antibiogramas del MINSAP (58), para medir el efecto antibacteriano y antifúngico se tomaron los halos de inhibición, se empleó además como referencias el valor de este parámetro para varios antibióticos. Los resultados obtenidos se presentan a continuación.

Grafico 1 Halos de inhibición del Protium cubense (hojas) frente a 4 microorganismos de referencia.

El Gráfico 1 muestra la comparación del halo de Inhibición que producen los extractos del Protium cubense contra las tres cepas de bacterias empleadas y contra la Candida albicans. Donde se representan valores importantes del halo de inhibición de los extractos (14 y 12mm) frente a Staphilococcus aureus a concentraciones del 100% y 50 % que según la escala de Bauer-Kirby vigente para el MINSAP se clasifica como sensible. Sin embargo para el resto de los microorganismos se obtienen halos de inhibición semejantes.

Debido a los valores de los halos de inhibición de los extractos del Protium cubense frente a Staphilococcus aureus se realizó una comparación con los valores obtenidos para este parámetro que producen varios antibióticos de uso corriente en el tratamiento de enfermedades bacterianas. Se pudo demostrar para un p<0.01que solo existen diferencias significativas de los halos de inhibición de la tetraciclina con respecto a los extractos de las hojas del Protium cubense a concentraciones de 100 y 50%, como se muestra en el Gráfico 2.

Gráfico 2 Comparación de los halos de inhibición de diferentes antibióticos y del Protium cubense (hojas) a diferentes concentraciones frente al Staphilococcus aureus.

A una concentración del 100% los extractos no mostraron diferencias significativas, mientras que al 50% el extracto del PCH (Protium cubense hojas) mostró un efecto antibacteriano significativamente superior a la vancomicina y un comportamiento similar a la estreptomicina. Sin embargo a una concentración del 1% los tres antibióticos ensayados se comportan de una manera similar al compararlos con los extractos del Protium cubense.

Gráfico 3 Halos de inhibición del Protium cubense (Corteza) contra 4 microorganismos de referencia

En el Gráfico 3 se representa la comparación de los halos de inhibición del Protium cubense (Corteza) contra los cuatro microorganismos. Al someter estos resultados a un análisis de varianza este obtuvo para un p<0.01, diferencias significativas entre los halos de inhibición de esta y el resto de los microorganismos empleados, así como para todas las concentraciones utilizadas. Este resultado demuestra la potente acción antibacteriana de las formulaciones obtenidas a partir de la corteza de esta planta.

Al comparar este resultado con los halos de inhibición que producen varios antibióticos a diferentes concentraciones se pudo demostrar para un p<0.01que solo existen diferencias significativas de los halos de inhibición de la tetraciclina con respecto a los extractos del Protium cubense a concentraciones de 100 y 50%, mientras que a la concentración del 1( existe una diferencia significativamente superior de los extractos del Protium cubense con relación a los demás antibióticos como se muestra en el Gráfico 4.

Gráfico 4 Comparación de los Halos de inhibición de diferentes Antibióticos y del Protium cubense (Corteza) frente al Staphilococcus aureus

A una concentración de 100% y el 50 % los extractos mostraron diferencias significativas con respecto a la tatraciclina a la estreptomicina y la vancomicina, siendo superior su acción frente esta bacteria, mientras que a una concentración del 1% los extractos del PC se comportan de manera superior en comparación con los tres antibióticos ensayados.

Este trabajo ha tenido entre sus finalidades no solo demostrar la acción antibacteriana y antifúngicas de extractos de esta planta sino encontrar entre los nuevos productos ensayados, cual es el de mejor perfil de acción contra cada microorganismo, para lo cual se ha realizado la comparación de cada uno de ellos en cada una de las concentraciones ensayadas experimentalmente y con el empleo de varios antibióticos como control.

Conclusiones

Luego de concluido el trabajo experimental y atendiendo a los resultados obtenidos se ha llegado a las siguientes conclusiones.

• 1. Se obtuvo la tintura y los extractos secos de la corteza y las hojas del Protium cubense, determinando las especificaciones de calidad de la tintura, se determinó la composición fitoquímica preliminar de cada una de las partes estudiadas y se comprobó que en las hojas predominan antocianidinas, cumarinas, flavonoides y quinonas y en la corteza la contienen además de los tres últimos, azúcares reductores.

• 2. Se demostró que la composición de la tintura al 20% del Protium cubense es semejantes a la composición de los extractos secos.

• 3. Se demostró que los extractos del Protium cubense tiene una potente acción antibacteriana contra Staphilococcus aureus. Mientras que se mostró inactivo frente a Pseudomona aeruginosa y Escherichia coli.

Recomendaciones

• 1. Emplear formulaciones de corteza y hojas del Protium cubense contra enfermedades producidas por Staphilococcus aureus y C. albicans.

• 2. Realizar estudios de toxicidad aguda a los extractos de las plantas estudiadas.

• 3. Ampliar los estudios in vitro a otros microorganismos.

• 4. Realizar estudios in vivo para corroborar las observaciones realizadas in vitro.

Literatura

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Autor:

Morales Sánchez, Yanelis Dr MVZ

Universidad de Granma

Fonseca Rodríguez Yunior Dr MVZ

Universidad de Granma

Peña Ricardo Alfredo DrC

Filial de Ciencias Médicas Bayamo

Zamora Castell Yudith, Lic

Filial de Ciencias Médicas Bayamo

Universidad de Granma

Facultad de Medicina Veterinaria

Departamento de Sanidad Animal