IVETIn Vivo Expression Technology
Tecnologías de expresión in vivo IVET Método de selección positiva: Sistema de selección de promotores de genes activados durante el proceso infectivo y que están poco o nada activos en el periodo no infectivo Proceso: Dos genes marcadores situados en tandem se fusionan aleatoriamente con fragmentos del genoma del microorganismo a estudiar generando una librería de fragmentos genómicos Se transforman las cepas a estudiar con la librería de fragmentos genómicos.
3. Se infecta al animal y se extraen las células supervivientes. Principio: El primer gen del tandem permita la supervivencia in vivo si es expresado. El segundo gen del tandem (lacZY) permite distinguir las cepas que se expresan in vitro: Color azul. Interesan los clones supervivientes que no se expresan in vitro: Colonias blancas extraídas del animal infectado. Genes testigo: ?purA, selección auxotrófica Genes de resistencia a antibióticos
Tecnologías de expresión in vivo IVET Método de selección negativa: Permite la detección de actividad de promotores durante un período muy corto de la infección Principio: Si el promotor esta activo la resolvasa eliminará el gen de resistencia a tetraciclina y por tanto el microorganismo pasara de resistente a sensible. Se añade tetraciclina in vitro y se buscan células sensibles a tetraciclina y blancas.
Tecnologías de expresión in vivo IVET IVET con selección auxotrófica: Genes testigo: purA y lacZ Salmonella typhimurium (se utilizó una cepa ?pur A) La disponibilidad de las purinas es limitante para el crecimiento de esta bacteria cuando infecta ratones Pseudomonas areuginosa Se identificaron loci implicados en susceptibilidad. IVET con selección antibiótica: Genes testigo: resistencia a cloranfenicol y lacZ Salmonella typhimurium En ratones Balb/c y en macrófagos en cultivo. Junto con la anterior se han identificado mas de 100 genes ivi, la mitad de ellos de función desconocida. Yersinia enterocolítica Se han identificado 48 genes. La mitad similares a otros conocidos, unos pocos con función desconocida pero similares a otros ya descritos y 18 completamente nuevos. IVET con resolvasa: Genes testigo: resolvasa y lacZ, además las cepas estudiadas portan una resistencia a tetraciclina. Vibrio cholerae Identificación de 13 genes ivi. Algunos homólogos a genes implicados en el metabolismo de aminoácidos, otros homólogos a genes de función desconocida o completamente nuevos. Staphylococcus aureus Identificados 45 genes ivi. Varios previamente conocidos. El resto similares a genes conocidos de otras especies o nuevos.
Differential Fluorescence Induction Método de selección positiva: Como gen testigo se utiliza la GFP (Green Flourescent Protein) Se utiliza un sistema automático de selección de células individuales según su fluorescencia FACS. Principio: Si el promotor está activo se sintetiza la GFP y la bacteria fluoresce. Se cultivan in vitro las bacterias fluorescentes in vivo y se seleccionan aquellas que pierden su fluorescencia en el nuevo medio. Salmonella thyphimurium.: Identificados 14 genes inducidos en macrófagos. 8 poseen homólogos en otras bacterias con función conocida 6 sin homología con otros genes u homólogos a genes de función desconocida
Differential Fluorescence Induction Salmonella typhimurium
Genómica funcional 1) Análisis de la activación de genes (Mutagénesis) IVET: In vivo expression technology DFI: Differential fluorescence induction STM: Signature -tagged mutagenesis GAMBIT: Genomic analysis and mapping by in vitro transposition
Tecnologías de expresión in vivo IVET IVET con selección auxotrófica: Genes testigo: purA y lacZ Salmonella typhimurium (se utilizó una cepa ?pur A) La disponibilidad de las purinas es limitante para el crecimiento de esta bacteria cuando infecta ratones Pseudomonas areuginosa Se identificaron loci implicados en susceptibilidad. IVET con selección antibiótica: Genes testigo: resistencia a cloranfenicol y lacZ Salmonella typhimurium En ratones Balb/c y en macrófagos en cultivo. Junto con la anterior se han identificado mas de 100 genes ivi, la mitad de ellos de función desconocida. Yersinia enterocolítica Se han identificado 48 genes. La mitad similares a otros conocidos, unos pocos con función desconocida pero similares a otros ya descritos y 18 completamente nuevos. IVET con resolvasa: Genes testigo: resolvasa y lacZ, además las cepas estudiadas portan una resistencia a tetraciclina. Vibrio cholerae Identificación de 13 genes ivi. Algunos homólogos a genes implicados en el metabolismo de aminoácidos, otros homólogos a genes de función desconocida o completamente nuevos. Staphylococcus aureus Identificados 45 genes ivi. Varios previamente conocidos. El resto similares a genes conocidos de otras especies o nuevos.
Signature-tagged mutagenesis
Signature-tagged mutagenesis (Gp:) DNA tag (o código de Barras
Signature-tagged mutagenesis
Signature-tagged mutagenesis
Factores limitantes de la STM STM evalúa la capacidad del patógeno para dividirse en una población heterogénea. Se espera que identifique genes de virulencia no compensables por otros patógenos virulentos del mismo inóculo. Factores determinantes: La complejidad del inóculo. La dosis La ruta de administración La duración de la infección
Desventajas de IVET y STM IVET: Dependen demasiado de la no expresión de genes “in vitro”. Desestima los genes que deban atenuarse durante la infección. Los genes ivi deben ser mutados posteriormente para demostrar su requerimiento en la infección. No detecta genes esenciales STM: No selecciona positivamente. Desestima los genes que deban atenuarse durante la infección. La mutagénesis puede no ser verdaderamente aleatoria. No detecta genes esenciales.
GAMBIT Principio: Sistema de identificación de genes esenciales para la supervivencia del microorganismo Útil en organismos cuyo genoma esta completamente secuenciado. Utiliza la técnica de footprinting por PCR Precisa de unos 130 cebadores por Mb de DNA investigado Sistema de selección negativo Aplicación práctica Haemophilus influenzae. En crecimiento in vivo y en infecciones en animales (ratón) Streptococcus pneumoniae. En crecimiento in vitro (Genomic analysis and mapping by in vitro transposition)
(Genomic analysis and mapping by in vitro transposition) GAMBIT
(Genomic analysis and mapping by in vitro transposition) GAMBIT
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