Metabolitos bacterianos (página )

5. Producción de metabolitos a partir de una cepa Burkholderia cepacia 0057

Evaluación de dos medios de cultivo: Se utilizaron dos medios de cultivo para evaluar el crecimiento de la bacteria y la producción de metabolitos. El medio King B modificado por su utilidad en la producción de metabolitos activos, se empleo con referencia y se comparó como medio sirope de fructuosa (Sp)(Ortiz, et al., 2001; Sánchez et al .,2004) que constituye la segunda formulación empleada que se estudio para el crecimiento bacteriano y la fisiología de cultivo y su correlación con la producción de AIA y ácido salicílico.

Tabla 1: Composición de los medios King B modificado y sirope fructuosa (Sp)

Los ensayos se realizaron en zaranda orbital de velocidad con frascos de 500 mL de capacidad con 200 mL de los medios seleccionados y se inocularon con suspensiones de células entre un 107-108 UFC/ mL en fase exponencial de crecimiento incubación de 20 horas a 37 0C con una velocidad de 200rpm.

Para caracterizar el crecimiento de la cepa estudiada con respecto al tiempo se llevo a cabo la lectura de las densidades ópticas con una absorbancia de 650 nm y el pH del cultivo. Se realizó el conteo de colonias viables (UFC/mL) mediante plaqueos con diluciones seriadas en medio King B agar (King et.al., 1954). Asimismo, se calculó los parámetros que determinaron si el crecimiento es efectivo o no, mediante la velocidad especifica de crecimiento en la fase exponencial de crecimiento (4-8 horas de crecimiento).

La cinética de producción de los metabolitos bacterianos como fitohormonas Acido 3 indol- acético (AIA); sideróforos y ácido salicílico (AS) por la cepa en ambos medios de cultivo, se determinó mediante la toma de muestra cada 2 horas y se procesaron las muestras según lo descrito por Hernández 2002.

Los estudios de crecimiento de la cepa B. cepacia en los dos medios evaluados demostraron resultaron adecuados y se pudo caracterizar las diferentes fases de crecimiento y realizar un estudio de su morfología. En al figura 1 se muestra la curva de crecimiento de B. cepacia en los dos medios donde se observa la fase exponencial de crecimiento a las 4 horas de incubación y entre las 6-8 horas de crecimiento comienza la fase de aceleración negativa. Los máximos valores de conteo de células viables fueron 2x 108 UFC/mL para el medio King B y de 4.5 x 108 UFC/mL en el medio sirope fructuosa. La fase estacionaria de crecimiento aparece a las 10 horas de crecimiento hasta 24 horas donde comienza a declinar

Figura 1. Curva de crecimiento de B. cepacia en medio King B y Sp

La µ en la fase logarítmica de crecimiento es de 0,18 h-1 para el medio King B modificado, mientras que el medio Sp se encontraron valores de 0,19 h-1, no encontrando diferencias significativas entre ambos medios

La aparición de los metabolitos en estudio en ambos medios aparece a las 10 horas de crecimiento coincidiendo con la fase estacionaria de crecimiento y se muestra como metabolitos secundarios no asociado al crecimiento celular (fig 2). A medida que pasa el tiempo de incubación, se incrementa su concentración hasta las 22 horas, donde se observa que comienza a disminuir la producción de los mismos debido presumiblemente a la liberación de enzimas intracelulares.. Estos resultados coinciden con los informados por Velásquez en (1999) al trabajar a nivel de laboratorio la producción de AIA y sideroforos por la cepa B. cepaciae 0057. Con respecto a la producción de metabolitos activos a diferentes tiempo de incubación en los medios bajo estas condiciones se constató que la mayor aparición se detecta a las 18 horas de cultivo, se demuestra diferencias significativa entre AIA, AS y los siderofóros a las 18 horas de incubación y el correspondiente a los restantes tiempo de incubación en los dos medios evaluados.

(A)

( B)

Figura 2: Curva de crecimiento y cinética de producción de metabolitos de B.cepaciae en medio Sp (A) y medio King B (B)

En este sentido, Hernández, y Santander 1999 demostraron que la producción de sideróforos en rizobacterias aisladas del cultivo del maíz, ocurre entre 16-18 horas de crecimiento (fase estacionaria) a una temperatura de 37 oC.

6. Diseño experimental, su aplicación al estudio de medios de cultivo.

La aplicación de la optimización experimental en la industria farmacéutica y biotecnológica internacional tiene una enorme trascendencia. Esta se utiliza para determinar las mejores condiciones en que se puede conducir un proceso donde no se dispone de otro modelo matemático que represente apropiadamente el comportamiento de la variable de interés, cuyo valor se desea hacer máximo o mínimo, con vistas a encontrar el valor óptimo será necesario recurrir a la experimentación y a la estadística (Díaz y Pita, 1996).

La solución de cualquier problema de optimización comienza con la formulación de los requisitos, de esto último depende frecuentemente la posibilidad de obtener la solución de un problema. También es necesario disponer de recursos de optimización para resolver el mismo, o sea, tener la libertad de elegir los valores en algunos factores de dirección del objetivo de optimización (Deiros, 1989).

Cuando el experimentador se halla frente a una serie de variables que dentro de unos límites puede modificar, y que esta modificación afecta a la respuesta o a un conjunto de ellas, se plantea el problema de hallar que combinación de dichas variables proporciona el conjunto de respuestas más satisfactorias El tratar de interpretar el efecto de las diferentes variables y su interrelación resulta altamente engorroso, y en oportunidades no se puede lograr toda la información deseada

En los problemas de optimización no solo es importante localizar el punto de máxima respuesta, sino también determinar la naturaleza de la superficie de respuesta en las proximidades del máximo o mínimo según el caso (Sevilla, 1989).De igual forma en la optimización de los procesos fermentativos aparece, entre otros problemas, la maximización de la cantidad de producto obtenido respecto al costo del medio cultivo empleado. El elevado número de componentes de los medios de cultivos sintéticos es una dificultad para su optimización puesto que obliga a realizar un elevado número de pruebas experimentales y a un complejo tratamiento de la información obtenida si se desean resultados satisfactorios.

Para el estudio de la naturaleza de los componentes del medio de cultivo, se eligen aquellos que se crean más adecuados, se realiza un diseño factorial 2 K y se estudia la influencia de los factores (Barberá et al.,1991).

El diseño factorial 2 K, comprende un experimento donde se utilizan cambios de todas las posibles combinaciones de los k factores a dos niveles. Este método es útil pues brinda información acerca del efecto de cada factor individual y además sobre el comportamiento de la superficie de respuesta al cambiar un factor bajo variedad de condiciones de los restantes factores de interés. Al ajustar un modelo mediante un diseño factorial, el primer paso es la codificación de las variables codificadas y al final el modelo ajustado se puede transformar en las variables originales (López, 1988).

La utilización de superficies de respuesta para llevar a cabo la optimización cuantitativa de las concentraciones de los componentes del medio de cultivo es de gran aplicación pues por este procedimiento se obtienen, primeramente, todos los resultados experimentales y luego se tratan matemáticamente ajustando una superficie de la que se obtiene el óptimo por cálculo. Esta vía es recomendable si la naturaleza del problema permite la realización de un gran número de pruebas de forma simultánea, aunque tiene el inconveniente de que el óptimo calculado no sea el real, por lo que debe ser aprobado.

La práctica habitual es realizar un único diseño de experiencia que se utiliza tanto para averiguar la influencia de los factores como para obtener la superficie respuesta (Barbera et al., 1991).

El caso mas simple que se puede encontrar es el de dos factores y una variable respuesta, el modelo matemático para esta respuesta describe una superficie tridimensional bajo el plano x-y (Khuri y Cornell, 1987).

Una problemática de la metodología de superficies de respuesta es la dificultad en la selección inicial de los valores de las variables operativas. La mayoría de los investigadores utilizan un rango arbitrario determinado por su experiencia. Si los valores iniciales son inadecuados la dirección hacia el óptimo será falsa y se necesitaran mas experimentos para encontrar el punto óptimo, tal punto, podría no ser encontrado (Kuo-Cheng et al., 1992).

7. Influencia de algunos componentes del medio Sirope Fructuos (Sp) en la producción de metabolitos de Burkholderia cepacia.

Para conocer la influencia de estos componentes se llevo a cabo un diseño de experimentos factorial a dos niveles (22) y un punto medio (Woiciechovoski et al 1999). Este diseño permitió el tamizado de las variables e indicó hacia donde mejoran los rendimientos (Sevilla, 1989). Las variables evaluadas (independiente) fueron cantidad de peptonas y cantidad de sirope fructuosa y como variable dependiente la cantidad de metabolitos producidos por la cepa de B.cepaciae. Los niveles seleccionados para las variables se muestran a continuación en la tabla 2

Tabla 2. Unidades físicas de las condiciones experimentales.

Tabla 3. Diseño factorial para la evaluación del medio Sp

Los resultados experimentales se analizaron por un ANOVA (es simple) y se trataron de ajustar a una ecuación polinomial de segundo orden por regresión múltiple.

Y= b0+ b1 X1+ b2 X2 +b3 X1 X2 +by X1 X1 +bs X2 X2

Donde: Y= Producción de Sirope (D.O).

b1= Coeficiente de la ecuación.

Se evaluó la significación de cada uno de los parámetros del modelo y se determinó la superficie respuesta empleando el sistema CSS (CSS: Stadistica, 1996).

Se obtuvo como resultado en cuanto a la producción de sideroforos, ácido sialicilico y AIA, las variables cantidad de Sirope- fructuosa así como la interacción sirope fructuosa y peptona fueron significativas. Del análisis de regresión múltiple se obtuvieron los siguientes modelos matemáticos y la superficie respuesta se muestra en la figura 5

Sideroforos = 11,48-1,4125X1+ 2,4625X2-5,3375 X1 X2

R2= 84,61 % P modelo<0,01

A

AS= 27,44- 5,5425 X1+ 9,0337 X2 -11,0925 X1 X2

B

C

AIA=16,3113-3,0941X1-0,7291X2-2.69583X1X2

Fig 5. Efecto de la cantidad de sirope fructuosa y peptona en la producción de de Sideroforos (A), Acido siálico( B) Y AIA (C).

Los modelos son significativos y la dirección es hacia los mayores rendimientos que orienta este experimento es hacia menores concentraciones de peptona y mayores concentraciones de sirope fructuosa, el punto máximo de producción de sideroforos fue 20,61µM, para AS de 53,112µg/ mL y para AIA 21,372 112µg/ mL cuando la concentración de sirope fructuosa es de 13,4 mL y la cantidad de peptona es 15 g.

A partir de estos resultados se pude conformar biopreparados que brindan magnificas posibilidades para su utilización como estimulador del crecimiento vegetal y/o gente de biocontrol una vez que se aseguren las condiciones de formulación del mismos (Ortiz, 2001) y de esta forma se trabajaría con productos naturales que no afectan al medio ambiente ni al equilibrio biológico del suelo

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Autor:

Lilian Sánchez*,

lilian[arroba]censa.edu.cu

Annia Hernández**

Sucel Ortiz**

*Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) Dirección de producciones Biofarmacéuticas.. Grupo Desarrollo.

* Instituto nacional de ciencias agrícolas

La Habana Cuba

Fecha 30 de Octubre del 2007