Manual de control de calidad en Microbiología clínica

1. INTRODUCCION
2. PREPARACION DE LAS MUESTRAS CLINICAS

1. Criterios para la obtención, transporte y recibo de muestras microbiológicas.

2. Criterios de rechazo de muestras clínicas.

3. Muestras desaprobadas debido a su cuestionable información.
4. Prioridad de las muestras

1. CONTROL DE CALIDAD

1. Control de calidad de los medios de cultivo.
2. Control de calidad de reactivos.
3. Control de calidad de tintes.
4. Control de calidad de antisueros.
5. Control de calidad de la prueba de sensibilidad a los antibióticos.

1. Control de calidad del medio de cultivo.
2. Control de calidad de los discos de sensibilidad a los antibióticos.
3. Control de calidad de la lectura e interpretación.
4. Control de calidad de la sensibilidad a los antibióticos en los sistemas computarizados.

1. Control de calidad de equipos y materiales de trabajo.
2. Control de calidad de equipos computarizados.
3. Control de calidad de fórmulas lácteas y mamaderas.
4. Control de calidad del agua destilada.

1. EL CEPARIO

1. Métodos de conservación de cepas bacterianas.
2. Mantenimiento del cepario
3. Cepas ATCC

4. Transporte de cepas bacterianas

1. SUPERVISION DE PERSONAL

1. Evaluación del personal

1. Programa de Docencia
2. Evaluación del informe final
3. Control de calidad externo.
4. Certificación del Laboratorio de Microbiología.

1. PROFORMAS DE REPORTES DEL CONTROL DE CALIDAD

1. Libro de reporte de control de calidad de medios en platos.
2. Libro de reportes de control de calidad de medios en tubos.
3. Libro de reporte de control de calidad de antisueros y reactivos.
4. Libro de reporte de control de calidad de fórmulas lácteas y mamaderas.
5. Libro de reporte de control de calidad de la sangre de carnero.
6. Libro de reporte de control de calidad de los discos de sensibilidad a los antibióticos.
7. Libro de control del cepario.

1. GLOSARIO DE TERMINOS ESTADISTICOS

H- BIBLIOGRAFIA DE REFERENCIA

ANEXO

LISTADO DE COMPAÑIAS SUPLIDORAS DE PRODUCTOS MICROBIOLOGICOS.

MANUAL DE CONTROL DE CALIDAD

EN MICROBIOLOGIA CLINICA

1. INTRODUCCION

El laboratorio clínico de microbiología moderno, requiere para su correcto funcionamiento de un adecuado y constante control de calidad sobre todas las etapas en el recibo, manejo y reporte de especimenes clínicos.

En general este control debe identificar, monitorear, evaluar y aprobar metodologías relativas al cuidado del paciente. En este contexto el control de calidad en Microbiología Clínica envuelve el monitoreo de los medios de cultivos, reactivos, instrumentos, procedimientos y el personal, para asegurar una adecuada práctica en el aislamiento, identificación y caracterización de agentes etiológicos y su correspondiente prueba de susceptibilidad como una guía de la terapia.

Un programa de control de calidad debe incluir además un Manual de Procedimientos, validación de metodologías y equipos, el desarrollo de ciclos de educación continuada, elementos de bioseguridad y una supervisión sobre los reportes generados. En éste sentido se hace énfasis en la correcta valoración de las pruebas de laboratorio, los agentes causales de enfermedades, el conocimiento de la flora normal ,la taxonomía bacteriana y la interpretación correcta de las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos.

El Aseguramiento de la Calidad, es un concepto un tanto más difícil de cuantificar que el control de calidad, ya que su foco es el impacto de las pruebas de laboratorio en el cuidado del paciente. Este control nos indica que tan bueno es nuestro trabajo y establece mecanismos para asegurar la generación de información de utilidad clínica rápida y segura. Este concepto incluye entrenamiento y calificación del personal, evaluación de los reportes, rapidez y seguridad diagnóstica, certificación de los laboratorios, controles externos, etc. El Control de Calidad y el Aseguramiento de la Calidad son similares en sus propósitos, aunque su significado y su manera de funcionar sean diferentes; sin embargo, ambos conceptos deben desarrollarse interactivamente durante un programa de control de calidad.

El control de calidad en el laboratorio tiene como objetivo , que el producto final del trabajo tenga un grado aceptable de seguridad , de conformidad con los limites establecidos. Debido a que la mayoría de los resultados en microbiología son producto de interpretaciones y evaluación de reacciones bioquímicas de seres vivos, donde la capacidad y experiencia del evaluador tienen un gran valor, los cálculos de coeficientes de variación y desviaciones estándares que son parte de funciones analíticas, tienen poca aplicación en el laboratorio de microbiología. Es por ello que algunos expertos consideran que el control de calidad en microbiología es mas un arte que una ciencia.

Un programa de control de calidad debe contar con los siguientes elementos mínimos:

• Las pruebas y los procedimientos.
• Verificación y validación del test.
• Manual de procedimientos.
• Mantenimiento de reportes y libros de registros.
• Evaluación del personal.
• Controles externos.

El programa evalúa y documenta el desempeño de todos los aspectos de un procedimiento. Esto incluye la calidad del espécimen, la eficiencia de los reactivos, medios e instrumentos y verifica los resultados del test por errores.

El Manual de Procedimientos del laboratorio de microbiología, debe contener todos los aspectos relevantes en la operación del laboratorio y la generación de reportes que tienen que ver con la salud de los pacientes.

El factor más importante en la generación de reportes microbiológicos de calidad corresponde al personal. El personal del laboratorio de microbiología debe ser escogido en base a sus cualidades académicas y personales. Debe poseer habilidad para ejecutar pruebas complejas, la mayoría de las veces manuales, interés en mantenerse al día en las ejecutorias y taxonomía bacteriana, excelente concepto de protección de grupo y de bioseguridad en general.

El control de calidad en resumen, es un elemento vital en el laboratorio, ya que ayuda en la confiabilidad de las pruebas, su reproducibilidad, asegura la calidad de los materiales, reactivos y equipos empleados, mejora la auto confianza del personal, detecta fallas que pueden reflejarse en el informe de resultados y en general provee un entorno de excelencia en todos los aspectos del trabajo.

Conociendo los elementos básicos que debe poseer un programa de control de calidad moderno, los albores de un nuevo milenio nos obligan a la confección de un Manual que pueda ser una guía para el personal dedicado a la microbiología clínica en el país, una disciplina de las Ciencias del Laboratorio en constante evolución que marcha a la par del progreso de la medicina moderna.

En atención a los inminentes cambios globales que traerán los años futuros, presentamos a la consideración de todos los colegas el siguiente Manual de Control de Calidad en Microbiología, el cual esperamos llene las expectativas y necesidades en nuestros laboratorios.

Lic. Eric Caballero J

E-Mail: ecaballe[arroba]sinfo.net

Octubre / 1999

1. PREPARACION DE LAS MUESTRAS CLINICAS

1. CRITERIOS PARA LA OBTENCION, TRANSPORTE Y

RECIBO DE MUESTRAS CLINICAS:

En términos de la efectividad del laboratorio de microbiología, nada es más importante que la apropiada selección, colección y transporte de las muestras clínicas.

Por ello todo el personal que tiene que ver con estas responsabilidades, debe comprender lo determinante que es el mantenimiento de la calidad de la muestra, en la evaluación e informe de un espécimen clínico. Es responsabilidad del laboratorio proveer ésta información en forma clara y que sea fácilmente incorporada en la metodología de trabajo de todas las salas de atención y hospitalización , el cual debe estar siempre accesible al personal de enfermería y médicos como una referencia.

Independientemente del hecho de que algunos tipos de muestras requieren metodologías de colección muy especiales, podemos enumerar algunos aspectos generales que deben ser tenidos en cuenta al coleccionar las muestras clínicas:

• La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso.
• Cuando se va a proceder a tomar un espécimen clínico, es importante evitar la contaminación con microorganismos saprofitos del área. Esta flora normal puede interferir con la interpretación del cultivo y enmascarar la presencia del verdadero agente etiológico de la enfermedad.
• Seleccione el tipo anatómico correcto donde se obtendrá el espécimen, y utilice la técnica apropiada y los instrumentos o elementos adecuados para su obtención.
• En el caso de investigar microorganismos anaeróbicos, la biopsia y el aspirado con aguja, son las muestras de elección. Los hisopos y sistemas tipo Culturette son los menos deseables para este fin.

Nunca refrigere una muestra por anaerobios.

• Coleccione un apropiado volumen de muestra.

Insuficiente material puede ser causa de resultados falso-negativos.

• Identifique cada muestra con el nombre del paciente, número de identificación personal ( Número de seguro social o Cédula de identidad personal ), procedencia, tipo de muestra, fecha de colección e iniciales del funcionario que tomó la muestra.
• Coloque la muestra en un receptáculo adecuado para su transporte con el fin de asegurar la sobrevivencia del posible agente infeccioso, evitar derrame del espécimen y mantener las medidas de bioseguridad apropiadas.
• Ordene siempre un frotis por gram para los especímenes que proceden de cavidades asépticas, y anote su interés en determinado microorganismo.

GUIA PARA LA COLECCIÓN DE ESPECIMENES CLINICOS

1. ABSCESOS , FÍSTULAS y HERIDAS :

• Limpie la superficie del absceso o herida con solución salina estéril o alcohol etílico al 70%.
• Si el absceso es cerrado, preferiblemente aspire con aguja la muestra de la base o de la pared de la lesión Cultive por anaerobios también.
• En caso de absceso abierto , fístula o herida, introduzca un hisopo profundamente dentro de la lesión, sin tocar el área superficial ya que puede introducir en la muestra bacterias que están colonizando la superficie y no están envueltas en el proceso infeccioso.
• No cultive lesiones secas, a menos que esté presente el exudado.
• De ser necesario, puede refrigerar la muestra hasta por 1 hora antes de enviar al laboratorio.
• No envíe solo pus, ya que ésta no es representativa de la lesión. La base y bordes activos de la lesión son mas apropiados.

1. HEMOCULTIVOS:

• Desinfecte el tapón de caucho del frasco de hemocultivos con alcohol etílico al 70%. No utilice solución de yodo para limpiar el caucho.
• Asépticamente desinfecte el sitio de la venopunción con alcohol etílico al 70% y luego con una preparación de yodo en círculos concéntricos hacia fuera del sitio elegido. Espere que el yodo seque y realice la punción sin palpar de nuevo.
• Coleccione la muestra de sangre a razón de 0.5 – 2 ml para niños y 5-10 ml para adultos en cada frasco. El volumen de sangre a cultivar es el factor más importante en la recuperación del microorganismo.
• Cada frasco debe ser servido con una punción diferente en diferentes tiempos, a menos que utilice a la vez frascos para organismos aeróbicos y anaeróbicos. Nunca llenar todos los frascos con sangre provenientes de una sola punción.
• No tomar sangre del catéter, a menos que se esté realizando un estudio epidemiológico.

1. QUEMADURAS :

• Limpiar y desbridar la superficie de la quemadura antes de proceder a coleccionar la muestra.
• Una pequeña cantidad de tejido puede ser apropiada para el cultivo.
• Si hay supuración utilice un Culturette.
• Solicite cultivo aerobio solamente.

1. CATETER :

• Limpie la piel alrededor del catéter con alcohol etílico al 70%.
• Asépticamente remueva el catéter y corte 5 cm de la punta distal y colóquela en un tubo o envase estéril sin medio de cultivo.
• Transporte inmediatamente al laboratorio para prevenir la desecación.
• Catéteres i.v aceptables para cultivos semicuantitativos son:

Central, CVP, Hickman, Broviac, periférico, arterial, umbilical, hiperalimentación, Swan-Ganz.

1. LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO :

• Asépticamente desinfecte con tintura de yodo al 2%.
• Inserte una aguja con estilete en el inter espacio L3-L4, L4-L5 ( niños )

ó L5-S1.

• Mida la presión del líquido.
• Coleccione de 1 – 3 ml de LCR en 4 tubos estériles previamente rotulados.
• Ordene en los tubos: Química, celularidad, frotis, cultivo, aglutinaciones.
• Si no logra obtener suficiente líquido, envíe lo colectado al laboratorio de microbiología primero.
• Envíe inmediatamente al laboratorio.
• Nunca refrigere el líquido cefalorraquídeo.
• En la requisición con los datos del paciente indique la edad y si ha habido antibioterapia previa.

6. ULCERA DE DECUBITO :

• Limpie la superficie con agua jabonosa y solución salina estéril.
• Tome una muestra de biopsia de tejido o un aspirado con jeringuilla de la lesión.
• Un hisopo no es la mejor escogencia para colectar la muestra, sin embargo, cuando no es posible de otra forma, presione vigorosamente el palillo en la base de la lesión para tomar la muestra.

1. OIDO :

• La timpanocentesis está reservada para casos complicados, recurrentes, que no responden a la antibioterapia y otitis media crónica.
• El espécimen de escogencia es un aspirado del tímpano, ya que éste fluido representa el proceso infeccioso, no así la flora del canal externo del oído.
• El hisopo no es recomendado para la colección de muestra para diagnosticar otitis media, ya que puede contaminarse con la flora externa. Solo en caso de ruptura del tímpano, se puede usar el hisopo para recoger el líquido.

En éste caso se debe limpiar previamente con un antiséptico el canal del oído externo.

• Indique en la orden médica si se trata de secreción de oído interno, o externo o líquido de timpanocentesis.
• No refrigere la muestra.
• No solicite cultivo por anaerobios.
• Transporte la muestra rápidamente al laboratorio.

1. OJOS :

• Tome muestra de cada ojo con diferentes hisopos previamente humedecidos con solución salina estéril, rotando el algodón por la superficie de la conjuntiva.

Esto es independiente de que solo un ojo esté infectado, ya que la muestra del ojo sano puede servir de control de la flora normal del paciente, y compararlo con el reporte del ojo infectado.

• Indique en la muestra , en los medios enviados y en la orden médica, si es ojo derecho o izquierdo en cada caso.
• Inocule directamente en medios de agar chocolate, agar sangre, sabouraud-dextrosa agar y tioglicolato.
• Utilice otro hisopo para colectar muestra para frotis , el cual debe ser inmediatamente colocado en la placa.
• En el caso de raspado corneal, el método es el mismo, solo que se utiliza una lanceta o aguja estéril para realizar el raspado de la lesión y se adiciona una placa para frotis por KOH.
• No utilice el término " ojo " o " ocular " para identificar la muestra. Sea más específico al describirla: Secreción conjuntival, secreción corneal, secreción acuosa o vítrea, etc.

1. HECES :

• Coloque la muestra dentro de un envase limpio, con cierre hermético y no necesariamente estéril. No solicite frotis por gram.
• No cultive si la muestra es dura o bien formada.
• No se recomienda el uso de Culturette, salvo para infantes y pacientes con diarrea activa. Si lo utiliza, recolecte mas de 2 g de muestra.
• Para estudios por Rotavirus y Clostridium difficile, envíe solo muestra diarreica, y no utilice hisopo.

1. LIQUIDOS CORPORALES : LIQUIDO PERITONEAL, ASCITICO, BILIS, SINOVIAL, PERITONEAL, PERICARDICO, PLEURAL Y TORACICO :

• Desinfecte el área con tintura de yodo al 2%.
• Obtenga la muestra vía aspiración con aguja percutanea o cirugía.
• Transporte inmediatamente al laboratorio.
• Puede enviar la muestra para cultivo inoculándola en una botella para hemocultivos. Anótelo en el rótulo.
• Siempre envíe una apropiada cantidad de líquido, dependiendo de las pruebas que requiera.
• Nunca envíe la muestra en hisopo.

1. LIQUIDO AMNIÓTICO:

• Coleccione por aspirado vía amniocentesis, cesárea o catéter intrauterino.
• La aspiración de la secreción vaginal no es aceptable debido a contaminación por la flora vaginal normal.
• Puede enviar en un tubo estéril o en un sistema de transporte para anaerobios.

1. SECRECION DE GLANDULA DE BARTHOLINO :

• Limpie los genitales externos con agua y jabón y descarte el exceso de secreción.
• Pus del absceso de la glándula puede ser colectado por palpación digital del ducto. Solicite frotis y cultivo por Gonococos.
• Aspire el líquido del ducto preferiblemente con aguja y jeringuilla.
• Puede utilizar un sistema de transporte para anaerobios.

1. CERVICAL O ENDOCERVICAL :

• Visualice el cérvix utilizando un especulo sin lubricante. Limpie el excedente de secreción.
• Remueva la mucosa y secreción del canal con un hisopo y descártelo.
• Con un nuevo hisopo estéril de alginato de calcio, dacrón o algodón no tóxico, obtenga muestra del canal endocervical.
• Preferiblemente inocule la muestra en un plato de Thayer-Martin y el resto envíelo al laboratorio.
• Con otro hisopo coleccione muestra para colocarla en una placa para frotis.
• Un cultivo anal puede ser colectado para acompañar la muestra cervical cuando se sospecha N.gonorrhoeae, ya que el recto podría ser el único sitio positivo

post-tratamiento.

• No refrigere la muestra. Envíe pronto al laboratorio de microbiología.

1. VAGINAL :

• El cultivo rutinario de secreción vaginal no es apropiado debido a la presencia de alto número de microorganismos saprofitos en el área que hacen difícil la interpretación del cultivo.
• Descarte el exceso de secreciones externas
• Obtenga la secreción de la mucosa vaginal con un palillo estéril no tóxico o con una pipeta.
• Con otro palillo obtenga una muestra y colóquela en una placa para frotis directo. Esta placa puede servir también para confirmar vaginosis bacteriana, candidiasis vaginal o Tricomoniasis.
• No solicite cultivo por anaerobios.

1. SECRECION URETRAL DAMAS :

• Colecte la muestra al menos 1 hora después que el paciente a orinado.
• Remueva el exudado del orificio uretral.
• Colecte la descarga de material en un hisopo no tóxico por masaje de la uretra.
• Si no hay descarga, lave la uretra externa con jabón Betadine y enjuague con agua. Inserte un hisopo 2 a 4 cm dentro de la uretra y rote el palillo.
• Envíe la muestra rápidamente al laboratorio.

1. SECRECION PROSTATICA:

• Colecte la muestra al menos 1 hora después que el paciente a orinado.
• Limpie el meato urinario con jabón antiséptico y agua.
• Proceda a masajear la próstata a través del recto.
• Coleccione el fluido en un hisopo estéril y no tóxico o en un tubo estéril.
• También es muy útil para recuperar gonococos el cultivo de orina después del masaje prostático.

1. SECRECION URETRAL VARONES :

• Colecte la muestra al menos 1 hora después que el paciente ha orinado.
• Inserte un hisopo urogenital 2-4 cm dentro del lumen de la uretra.

Rote el hisopo..

• Preferiblemente inocule directamente en un medio de Thayer-Martin.
• Utilice otro hisopo para tomar muestra para el frotis directo.

La placa debe ser hecha en el sitio.

• No refrigere la muestra.
• Envíe rápidamente al laboratorio. Solicite antígenos por Chlamydia y cultivo por Mycoplasma.
• No solicite cultivo por anaerobios.

1. NASAL :

• Inserte un hisopo humedecido con solución salina estéril +/- 2 cm dentro de la fosa nasal.
• Rote el hisopo contra la mucosa nasal. Colóquelo en un medio de transporte.
• Envíe al laboratorio
• El cultivo de la fosa nasal anterior, solo está reservado para la detección de portadores de Staphylococcus aureus y/o Estreptococos betahemolíticos o en caso de lesión.
• No refrigere la muestra.
• El cultivo nasal no predice el agente etiológico de infecciones en oído medio o el tracto respiratorio inferior.
• No cultive por anaerobios.

1. NASOFARINGEO:

• La muestra debe ser tomada evitando la contaminación con la flora nasal u oral.
• Lentamente inserte un hisopo de alginato de calcio dentro de la nasofaringe posterior, vía fosas nasales. Puede usar un especulo nasal.
• Rote lentamente el hisopo para absorber secreción.
• Inocule en medios de agar sangre y agar chocolate en el sitio o envíe al laboratorio.
• La muestra nasofaríngea es muy útil para detectar portadores de Meningococos o en caso de sospecha de tos ferina.
• El cultivo rutinario de la nasofaringe no es recomendado.

1. FARINGE :

• Utilizando un depresor lingual presione la lengua hacia abajo para observar los pilares de la faringe y el área tonsilar para localizar el área de inflamación y exudado.
• Utilizando un hisopo de alginato de calcio o de Dacrón, rote el mismo sobre el área de exudado, las tonsilas y faringe posterior.

No toque el resto del área de la cavidad oral o los dientes.

• Envíe al laboratorio.
• Si el transporte demora, refrigere el Culturette hasta por 1 hora.
• No solicite frotis directo de faringe.
• Indique si requiere cultivo o prueba directa de detección de antígenos.
• Indique si hay sospecha de otro patógeno diferente a Estreptococos betahemolíticos ( Ejemplo N. Gonorrhoeae ).
• El cultivo de faringe está contraindicado en pacientes con epiglotis inflamada.

1. ESPUTO POR EXPECTORACION :

• El esputo podría no ser la muestra apropiada para determinar el agente etiológico de neumonía bacteriana. La sangre, el lavado bronquial o el aspirado transtraqueal son mas seguros.
• Es recomendable que la muestra sea tomada en la mañana al levantarse.
• Haga que el paciente se enjuague la boca con agua antes de expectorar, para remover la flora superficial oral.
• Si el paciente tiene dentadura postiza, se la debe quitar.
• Instruya al paciente para que tosa con fuerza y profundo, tal que obtenga un esputo que provenga del tracto respiratorio inferior. Explíquele que es el esputo.
• Depositarlo directamente en un envase estéril. No colecte saliva ni fluido post-nasal. Ordene un frotis por gram para confirmar la validez del esputo.
• Para pacientes pediátricos que no pueden producir la muestra apropiada, un terapista respiratorio puede colectar la muestra por succión.
• Si la muestra no puede ser llevada al laboratorio, puede refrigerarse.
• Indique en la orden médica los microorganismos de interés, ya sea por bacterias, hongos o micobacterias, cada una con un formulario diferente.
• Para el diagnóstico de la tuberculosis colecte 2 muestras en días consecutivos.

1. ESPUTO INDUCIDO :

• Haga que el paciente se enjuague la boca con agua.
• Con ayuda de un nebulizador, haga que el paciente inhale aerosoles de una solución salina estéril al 3-10%.
• Colecte el esputo inducido en un envase estéril.

1. ASPIRADO TRAQUEAL :

• Colecte el espécimen a través de una traqueotomía o tubo endotraqueal.
• Con cuidado pase el catéter de polyetileno a través del sitio dentro de la tráquea.
• Aspire el material de la tráquea utilizando una jeringuilla o un succionador intermitente.
• Remueva el catéter y descarte la jeringuilla.
• Envíe al laboratorio.
• No refrigere la muestra.

1. ASPIRADO TRANSTRAQUEAL :

• Utilice este método cuando su resultado puede influir grandemente en la terapia, cuando los procedimientos no invasivos no han sido productivos, cuando la infección no está siendo controlada, cuando se sospeche infección por anaerobios o cuando el paciente está comatoso.
• Anestesie la piel del sitio de la colección y prepare asépticamente el área.
• Inserte una aguja calibre 14 a través de la membrana cricotiroidea.
• Pase un catéter de polyetileno calibre 16 a través de la aguja hacia la tráquea inferior. Remueva la aguja.
• Aspire la secreción con una jeringuilla de 20 ml o un succionador.
• Si la secreción es escasa, inyecte lentamente de 2 a 4 ml de solución salina estéril para inducir la tos, lo que usualmente produce un adecuado espécimen.
• Envíe el envase colector con el tubo incrustado al laboratorio prontamente.
• Evite la entrada de aire al envase colector.
• No refrigere la muestra.

1. MUESTRA POR BRONCOSCOPIA :

• Colecte el espécimen vía broncoscopio.
• El cepillado bronquial es preferido al lavado, ya que el lavado es más diluido.
• Anestesie el área con Lidocaina tópica al 2% preferiblemente.
• Haga que el paciente inhale por la boca y exhale por la nariz.
• Lubrique ambas fosas nasales con Xylocaina en jalea.
• El paciente pudiera necesitar Demerol intravenoso para tolerar el broncoscopio.
• Lubrique el broncoscopio con Xylocaina al 2% en jalea, evitando tocar la punta distal.
• Introduzca el broncoscopio intranasalmente.
• PARA LAVADO BRONQUIAL
• Sujete una trampa de Lukens al broncoscopio.
• Introduzca 10 ml de solución salina no bacteriostática a través del canal abierto.
• Succione el material desde afuera.
• Selle el tubo de la trampa y envíe al laboratorio.
• PARA CEPILLADO BRONQUIAL
• Utilice un broncoscopio de doble lumen.
• Inserte la brocha citológica dentro del canal abierto del broncoscopio y avance.
• Empuje la brocha fuera de su protector y realice el cepillado.
• Jale la brocha hacia dentro de su protector y remueva la unidad de brocha completa.
• Coloque la brocha dentro del tubo de transporte conteniendo solución salina o

Ringer’s lactato.

• Recuerde que la brocha se seca al aire rápidamente, lo cual es negativo para el cultivo
• Envíe al laboratorio inmediatamente.
• Si desea estudio por micobacterias, puede colocar la brocha dentro de un tubo conteniendo 10 ml de caldo de Middlebrook 7H9.
• PARA LAVADO BRONQUIO-ALVEOLAR ( BAL ) :
• Sujete una trampa de espécimen de 70 ml al broncoscopio.
• Introduzca 100 ml de salina no bacteriostática a través del canal en pociones de 20 ml.
• Después de la tercera o cuarta inyección de salina, reemplace la trampa de 70 ml por una de 40 ml..
• Envíe las trampas al laboratorio ó 10 ml de líquido de cada una en tubos estériles.

COMENTARIO: El mayor problema con el lavado bronquial, es la inhibición de las bacterias por la solución anestésica.

El cepillado bronquial solamente obtiene 0.001 ml de muestra, por lo que la brocha debe ser rápidamente colocada en el líquido de transporte para evitar la desecación.

La muestra colectada vía broncoscopio puede ser fácilmente contaminada con la flora oral. Esto puede reducirse utilizando un broncoscopio de triple lumen.

El lavado bronquioalveolar es preferido especialmente cuando el cultivo de esputo no ha sido satisfactorio.

El análisis cuantitativo de la muestra por lavado broncoalveolar, es clínicamente más relevante que el análisis de la muestra de esputo.

1. ORINA POR VACIADO DIRECTO :

• Se recomienda recoger la primera orina de la mañana al despertar.
• Lave los genitales con jabón y abundante agua. Secar con un paño limpio.
• Dejar escapar la primera porción de orina y a continuación recoger la muestra directamente en un envase estéril.
• Enviar inmediatamente al laboratorio. Si no se puede, refrigerar la orina hasta por 2 horas.
• No utilizar orina de receptáculos.
• NO utilizar orina de pool de 24 horas .
• No solicitar cultivo por anaerobios.
• El frotis directo por Gram de orina de mujeres recolectadas por vaciado directo, no es del todo confiable, ya puede estar contaminado por microorganismos de la flora normal vaginal.

1. ORINA POR CATETERIZACION :

• Limpie la porción del cateter donde se va a tomar la muestra de orina con alcohol etílico al 70 %.
• Inserte la aguja dentro del cateter y colecte la orina dentro de la jeringuilla.
• Transfiera la orina a un envase estéril.
• Enviar inmediatamente al laboratorio. En caso contrario refrigerar la orina.
• La colección de la orina por cateterización uretral tiene algún riesgo de forzar hacia la vejiga, parte de la flora normal uretral durante la inserción del catéter.
• Nunca recoja orina de la bolsa del catéter.
• No desconecte el catéter de su bolsa durante la colección de la muestra.
• Paciente con catéter por 48h – 72h pueden ser colonizados con múltiples cepas bacterianas.
• Indique en la orden médica si la orina ha sido colectada por catéter.

1. ORINA POR ASPIRACION SUPRAPUBICA :

• Mediante técnicas asépticas descontamine y anestesie el área de la punción.
• Introduzca la aguja calibre 22 dentro de la vejiga entre el pubis y el ombligo.
• Aspire alrededor de 20 ml de la vejiga y transfiera la orina asépticamente a un envase estéril o tape la aguja y envíe la jeringuilla.
• Enviar inmediatamente al laboratorio, o refrigerar.
• Esta técnica evita la contaminación de la orina por microorganismos de la uretra o perianales.
• Es útil cuando se sospecha infección por anaerobios, en pacientes pediátricos si hay problema en la colección de la orina, pacientes con trauma en la médula espinal y en general en aquellos en que el método del vaciado directo o cateterización no ha sido posible.
• Indique en la orden médica cuando la orina ha sido colectada por punción suprapúbica.

TRANSPORTE DE LA MUESTRA

1. La mayoría de las especies bacterianas son vulnerables a demoras en

su procesamiento, cambios de temperatura, humedad, etc. Durante el transporte las bacterias de rápido crecimiento, pueden crecer sobre los patógenos más fastidiosos y de crecimiento lento o con requerimientos especiales, por lo que es vital en el éxito del cultivo que la muestra sea transportada y procesada con la celeridad necesaria.

1. Todas las muestras deben ser enviadas inmediatamente al laboratorio después de colectadas. Se debe instruir al personal médico, de enfermería y mensajeros en la importancia de un transporte expedito de las muestras clínicas.
2. En los casos en que el transporte o el procesamiento pudieran demorar, se establecen a continuación las condiciones de temperatura para algunos tipos de muestras:

• MANTENIMIENTO A 4 °C :

Tejido de autopsia, lavado bronquial, catéter i.v , Biopsia de pulmón ,

líquido pericardico, esputo, orina., quemaduras, oído externo.

• MANTENIMIENTO A TEMPERATURA AMBIENTE :

Muestras de LCR, Líquido sinovial,, abdominal y amniótico, bilis, Cul-de-Sac, aspirado de pulmón, lesión, placenta, nasal, aspirado transtraqueal,

orina suprapúbica, raspado corneal, sangre, humor vítreo, médula ósea,

cérvix, conjuntiva, genitales, heces, nasofaríngeo, tracto respiratorio superior., heridas, cultivos por anaerobios, ocular, genital, oído interno.

1. En general no guarde una muestra por mas de 24h bajo ninguna condición.

2. Sin embargo, los virus permanecen estables por 2 a 3 días en medios de

   transporte apropiados.

3. El transporte óptimo de la muestra depende en gran parte del volumen obtenido. Mientras menor sea su volumen, con mayor rapidez debe transportarse.

   N. meningitidis, N. gonorrhoeae y H. influenzae se recomienda sembrar

   directamente en platos en el sitio de colección de la muestra.

4. Microorganismos sensitivos a las condiciones ambientales, como

   Tenga en cuenta que los medios de transporte están formulados para mantener la viabilidad de los microorganismos, sin embargo, algunos podrían no sobrevivir en un medio pobre en elementos nutricionales específicos.

5. Si se anticipa que habrá demora en el envío de la muestra o si el cultivo ha de ser enviado a otro laboratorio, se recomienda utilizar medios de transporte adecuados como Stuart, Amies o Cary-Blair. No enviar hisopos.
6. Siempre que sea posible, las muestras deben ser enviadas directamente y en forma inmediata al laboratorio de microbiología, sin utilizar las áreas de recibo central u otros departamentos del laboratorio.

1. CRITERIOS DE RECHAZO DE MUESTRAS CLINICAS :

El personal del laboratorio debe tener siempre presente que los especímenes clínicos que son enviados para su evaluación, representan elementos de suma importancia en la detección, evaluación y control de enfermedades potencialmente peligrosas que aquejan al paciente y que la rapidez y eficiencia con que se logre obtener información de utilidad clínica de las mismas, tendrá repercusiones directas en la salud del paciente, el manejo racional y adecuado de los recursos del laboratorio, la seguridad del resto de los pacientes y el personal que allí labora, el control de los antibióticos, el tiempo de hospitalización, disminución de costos de operaciones y en general la credibilidad del laboratorio y el hospital en general.

Por todo lo anterior las muestras que son recibidas por el laboratorio, deben ser apropiadamente colectadas, transportadas y procesadas. Estas muestras deben representar la causa probable de infección, de lo contrario el procesamiento y reporte de muestras no adecuadas puede proveer información equivocada, lo cual puede llevar a un mal diagnóstico y por consiguiente fallas en el tratamiento que pueden poner en peligro la vida del paciente.

Consecuentemente, el laboratorio debe poner en ejecución una política estricta de aceptabilidad y rechazo de muestras clínicas.

Causales de rechazo de muestras clínicas :

1. Muestras no rotuladas o sin identificación.
2. Discrepancia en la identificación del paciente y la muestra.
3. Envase inapropiado o medio de transporte inadecuado.
4. Demora prolongada en enviar la muestra al laboratorio.

   excepto sangre.

5. Duplicación de muestra del mismo paciente dentro de 24h,
6. No indicar tipo de muestra o procedencia.
7. No indicar tipo de examen en la orden.
8. Muestra con preservativos.
9. Muestra derramada o rotura del envase.
10. Hisopos secos.
11. Un solo Culturette con múltiples ordenes.
12. Muestra para anaerobios en envase inapropiado.
13. Cultivo por anaerobios de muestras con flora anaeróbica normal.
14. Frotis de Gram por N. gonorrhoeae de muestras de cérvix, vagina y cripta anal, ya que pueden haber Neisserias saprófitas en el área.
15. Cultivo por anaerobios de orina colectada por vaciado directo.
16. Orina colectada de la bolsa del catéter.
17. Saliva.
18. Frotis directo por Gram de hisopos.
19. Volumen inadecuado.
20. Contaminación obvia de la muestra.

Nota: El rechazo de una muestra debe estar acompañado de la solicitud de un nuevo especímen. Es conveniente notificarlo directamente al médico solicitante.

1. MUESTRAS DESAPROBADAS DEBIDO A SU CUSTIONABLE INFORMACION CLINICA :

1. Hisopo superficial oral.
2. Hisopo de úlcera de decúbito.
3. Hisopo de úlceras varicosas.
4. Hisopo de lesión superficial gangrenosa.
5. Contenido de vejiga.
6. Vómito.
7. Punta de catéter Foley.
8. Descarga de colostomía.
9. Loquios.
10. Aspirado gástrico de recién nacido.
11. Frotis faríngeo, nasal, orina o heces.

Muestras no adecuadas para cultivo por anaerobios :

1. Lavado bronquioalveolar desprotegido.
2. Hisopo cervical.
3. Aspirado endotraqueal.
4. Loquios.
5. Hisopo nasofaríngeo / Secreción faríngea.
6. Líquido seminal o prostático.
7. Esputo por expectoración o inducido.
8. Heces o muestra rectal.
9. Secreción uretral / hisopo vaginal o vulvar.
10. Orina por vaciado directo o catéter.

4. PRIORIDAD DE LAS MUESTRAS :

Todas las muestras deben ser procesadas lo más rápidamente posible al llegar al laboratorio. Sin embargo, su manejo puede ser clasificado de la siguiente manera, independientemente de su orden .

MUESTRAS URGENTES

• Sangre.
• LCR. ( Su estudio tiene Prioridad sobre cualquier otra muestra o trabajo ).
• Aspirado Transtraqueal
• Líquido pericardico.
• Líquido amniótico.
• Tracto respiratorio inferior.
• Muestras quirúrgicas de la sala de CIC.
• Líquido articular ( Artritis séptica ).
• Biopsia de Pulmón.

Nota: Cuando éstas muestras se encuentran rotuladas con la advertencia "Stat" o

" Urgente", los resultados deben ser informados telefónicamente al médico solicitante.

MUESTRAS DE RUTINA

• Boca.
• Líquido pleural.
• Quemaduras.
• Ocular.
• Orina.
• Genitales
• Muestras quirúrgicas.
• Líquido peritoneal.

MUESTRAS ELECTIVAS

• Líquido ascítico.
• Bilis.
• Líquido articular ( No artritis ).
• Líquidos intravenosos.
• Genitales
• Nasal.
• Oído.
• Nasofaríngeo.
• Rectal.
• Ulceras, vesículas.
• Piel.
• Post Mortem.

1. CONTROL DE CALIDAD

1. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

1. Los medios de cultivo deshidratados son higroscópicos y la absorción de agua del exterior, así como la formación de agua dentro de la botella como consecuencia de las fluctuaciones de temperatura en el ambiente, favorecen el crecimiento bacteriano. Esto puede conducir al consumo de nutrientes, variaciones de Ph y cambios en el color del medio. Además la exposición a la luz puede llevar a importantes alteraciones en los constituyentes del medio de cultivo.

   Se debe mantener un registro de cada frasco de medio de cultivo deshidratado, con el nombre del producto, nombre y número telefónico de la casa proveedora, número de control del frasco, fecha de recibo, fecha de expiración, número de lote y fecha en que se abrió el frasco.

2. Tomando en cuenta los factores antes señalados, los medios de cultivo deshidratados deben almacenarse siempre en lugares frescos, a temperatura ambiente y protegidos contra la humedad y la luz. La mayoría de los suplementos se guardan en refrigeración. Utilizando condiciones de almacenamiento adecuadas, los medios elaborados en polvo tienen una vida útil de al menos 3 años. El material que ha sufrido cambios substanciales, tales como hidratación, endurecimiento y cambio de color, deben descartarse.
3. El grado de disolución de un medio deshidratado, así como la eficacia del mismo ya preparado, depende en gran medida del procedimiento empleado en la rehidratación. Se recomienda utilizar agua recién destilada o completamente desmineralizada y un erlenmeyer con capacidad del doble del medio que se quiere preparar. Si el medio va a distribuirse en tubos, debe agitarse constantemente para asegurar una adecuada homogenización al momento de servirlos.
4. Cuando se va a esterilizar, debe asegurarse en seguir las instrucciones de tiempo, presión y temperatura para la obtención de medios de cultivo óptimos. Una temperatura de 121 °C , presión de 15 libras y un tiempo de esterilización de 15 minutos, son suficientes para la mayoría de los medios.

Si no se dispone de autoclave, es posible esterilizar en marmita de

vapor a 100 °C por 30 minutos. En tal caso la esterilización debe

repetirse durante 3 días consecutivos.

5) El medio esterilizado debe ser enfriado a 45°-60°C en un baño maría, para

evitar la formación de agua de condensación. Al ser vertidos en las placas Petri,

evitar la formación de burbujas y coágulos. Durante el proceso de servida, debe

tomarse una muestra del medio para realizar el control de calidad por esterilidad

y eficiencia.

6. El medio de cultivo reconstituido tiene una vida útil limitada. Si no se emplea

7. de inmediato, debe almacenarse bajo condiciones apropiadas para garantizar su

   utilidad durante un periodo de tiempo.

   El almacenamiento a 4°C es el mejor para la mayoría de los medios.

   Sin embargo, aquellos que contienen Tioglicolato, deben guardarse a

   temperatura ambiente.

8. Los medios deben mantenerse preferiblemente en sitios oscuros, ya que la luz puede afectar algunos de sus componentes. Para evitar la desecación se aconseja que se guarden en bolsas plásticas bien cerradas. Los platos Petri almacenados así, deben mantenerse con el fondo hacia arriba.

   aislamiento o en los casos de pruebas de sensibilidad a los antibióticos en los

   que el exceso de agua puede afectar la dilución de las colonias y por ende la

   lectura del halo de inhibición.

9. Dado que los medios almacenados en refrigeración, cuando pasan a temperatura ambiente tienden a formar agua de condensación en la superficie, se recomienda poner los platos Petri en la incubadora a 35°C por 2 horas, colocándolos con el fondo hacia arriba para obtener una superficie seca. Esto es particularmente importante para que el agua no afecte la individualidad de las colonias en el

   eficiencia o calidad, mediante la inoculación de microorganismos cuyo

   comportamiento conocemos, tanto para reacciones positivas como negativas.

   Puede utilizarse para ello cepas bacterianas domésticas o cepas control

   comerciales ( ATCC ).

   Se debe guardar un libro de registro de los resultados obtenidos.

10. Cada lote preparado de medio de cultivo se prueba antes de su uso rutinario, por
11. Evite el congelamiento de los medios preparados o la sangre de carnero.
12. Al colocar en la refrigeradora los medios preparados, debe colocar los de más reciente preparación al fondo y los mas viejos adelante.
13. Rotular todos los medios preparados, tanto en platos Petri como en tubos, indicando además, la fecha de preparación y expiración.

PRUEBAS BASICAS DE CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS PREPARADOS:

1. Ph
2. Esterilidad
3. Capacidad de crecimiento y reacción
4. Estabilidad

CRITERIOS DE CALIDAD DE LOS MEDIOS PREPARADOS:

1. Rajadura del plato o envase.
2. Rajadura en la superficie del medio.
3. Variaciones en el volumen del medio.
4. Hemólisis.
5. Cristales en el medio.
6. Presencia de burbujas.
7. Presencia de coágulos.
8. Cambio de color normal.
9. Contaminación.
10. Falla en la inhibición de microorganismos saprófitos.

FALLAS Y CAUSAS EN LA PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO :

1. Valor de Ph incorrecto:

• Medir el Ph por encima de los 25°C.
• Sobrecalentamiento en la esterilización, vuelta a fundir o calentamiento prolongado a 50°C.
• Solución incompleta del medio.
• Mala calidad del agua.
• Recipiente mal lavado o con residuos químicos.
• Mala conservación del medio deshidratado o vencido.

1. Turbidéz o precipitación :

• Mala calidad del agua.
• Sobrecalentamiento.
• Ph incorrecto.
• Solución incompleta.

1. Oscurecimiento :

• Sobrecalentamiento.
• Solución incompleta.
• Alteración del Ph.

1. Gel blando :

• Bajo porcentaje de agar en el medio.
• Errores en la pesada del medio deshidratado o en los suplementos.
• Sobrecalentamiento.
• Mala homogenización del medio.
• Exceso de agua.

1. Crecimiento bacteriano pobre :

• Exceso de calentamiento.
• Substancias inhibidoras en el agua o en el recipiente.
• Alteración en el Ph.

EVALUACION DE LA EFICIENCIA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO PREPARADOS :

MEDIO DE CULTIVO ORGANISMO CONTROL REACCION ESPERADA

TSI E. coli ácido/ácido

TSI Shigella flexnerii alcalino/ácido

TSI Pseudomona aeruginosa alcalino/alcalino

SIM Proteus mirabilis movilidad positiva

SIM K. pneumoniae movilidad negativa

Citrato de Simmons K.pneumoniae color azul. Crece

Citrato de Simmons E. coli color verde. No crece.

Caldo de urea Proteus mirabilis Rojo-Morado. Positivo.

Caldo de urea E. coli color Naranja. Negativo.

Agar sangre Estr.Betahem.Grupo B Crece. Betahemólisis.

Agar sangre S. pneumoniae Crece. Alfahemólisis.

Agar sangre K.pneumoniae Crece. No hemolítico.

McConkey E. coli Crece. Colonias moradas.

McConkey Proteus sp Crece. Colonias claras.

McConkey Estafilococos No crece.

McConkey Sorbitol E.coli 0157:H7 Colonias claras. Sorbitol negativo

McConkey Sorbitol Proteus sp Colonias claras. Sorbitol negativo

McConkey Sorbitol Klebsiella sp Colonias rosadas. Sorbitol positivo

EMB E. coli Brillo metálico

EMB Proteus sp colonias Claras

Manitol Sal Estafilococos Colonias amarillas

Manitol Sal E. coli No crece.

SS agar Salmonella sp Crece. Colonias claras con H2S

SS agar E. coli No crece.

Agar alcohol-fenil etílico Estafilococos Crece.

Agar alcohol-fenil etílico E. coli No crece.

Thayer-Martin N. gonorrhoeae Crece.

Thayer-Martin E. coli No crece.

OF – medio E. coli Amarillo ambos tubos. Fermentador

OF – medio Pseudomona sp Un tubo amarillo. Oxidativo

OF – medio Moraxella sp Ningún tubo amarillo. Inerte

MEDIO DE CULTIVO ORGANISMO CONTROL REACCION ESPERADA

Lysina decarboxylasa Citrobacter freundii alcalino/ácido H2S +

Lysina decarboxylasa Proteus vulgaris Rojo/ácido H2S –

Lysina decarboxylasa Salmonella arizonae Alcalino/alcalino H2S +

Bili-Esculina Streptococcus mitis Incoloro

Bili-Esculina Enterococcus faecalis Negro

Caldo Malonato Klebsiella pneumoniae Azul

Caldo Malonato E. coli No cambia el color

NaCl 6.5% Streptococcus mitis No crece

NaCl 6.5% Enterococcus faecalis Crece

Sabouraud-Dextrosa agar Levaduras Crece

Sabouraud-Dextrosa agar Dermatofitos Crece

Sabouraud-Dextrosa agar Estafilococos Crece

Mycosel agar Levaduras Crece

Tioglicolato Flora mixta Crece

Selenita Flora mixta Crece en menos de 24h

Caldo Cerebro-Corazón Flora mixta Crece

CONTROL DE CALIDAD DE LOS SUPLEMENTOS :

1. Es importante tener en cuenta que los suplementos de los medios de cultivo,

2. pudieran confrontar problemas de eficiencia o inhibición, ya que como todo

   producto pudiera no haber sido almacenado y/o transportado adecuadamente.

   Solo el uso rutinario de los medios de cultivo preparados con éstos

   suplementos, pudieran darnos la alarma de problemas en los mismos.

   de la esterilización para evitar su deterioro.

3. Muchos suplementos son lábiles al calor, por ello se añaden al medio después

   dentro de los 8 días siguientes a su preparación ya que la eficacia de la mezcla

   decrece muy rápidamente. La misma advertencia es aplicable a los frascos de

   VCN rehidratados, por lo que conviene guardarlos congelados si no se va a

   usar de inmediato. No sobrepasar los 15 días.

4. Los medios preparados con la mezcla inhibidora VCN , deben ser utilizados
5. En el caso de la sangre de carnero para la preparación del agar sangre, es

importante cada vez que se reciba un nuevo lote, anotar su apariencia, observar por presencia de coágulos, hemólisis, número de lote, fecha de recibo y expiración, hacerle una determinación de hemoglobina, la cual debe medir entre los 13.0 – 15.0 g/dl, y por supuesto se debe tomar con una jeringuilla una pequeña muestra del vial para sembrarla en agar sangre y tioglicolato para determinar su esterilidad. También se debe examinar el agar sangre preparado con sangre de carnero, por adecuada formación de hemólisis, especialmente utilizando Estreptococos hemolíticos.

1. Un elemento fundamental en el trabajo diario del laboratorio, lo constituyen los reactivos, tanto comerciales como de preparación doméstica, que son utilizados en la caracterización de microorganismos. Estos reactivos merecen una especial atención, toda vez que fallas en su funcionamiento pueden generar en identificaciones equivocadas.

   Por ello, se recomienda correr controles diarios con las bacterias tipo y seguir estrictamente las indicaciones en cuanto almacenamiento de los reactivos, metodología de la prueba y tiempo de lectura.

   Es recomendable que los reactivos comerciales sean examinados inmediatamente cuando se abre un nuevo lote o vial y llevar un registro de su funcionamiento.

   REACTIVO MICROORGANISMO REACCION ESPERADA

   Coagulasa Staphylococcus aureus Coágulo. Coagulasa positiva

   Coagulasa Cepa ATCC 25923 Coágulo. Coagulasa positiva

   Coagulasa Stafilococcus epidermidis Inerte. Coagulasa negativa

   Oxidasa Pseudomona aeruginosa Negro. Oxidasa positiva

   Oxidasa E. coli Inerte. Oxidasa negativa

   Catalasa Staphylococcus sp Burbujas. Catalasa positiva

   Catalasa Streptococcus sp Inerte . Catalasa negativa

   Betalactamasa S. aureus ATCC 29213 Rojo. Positiva

   Betalactamasa H. influenzae ATCC 10211 Inerte. Negativa

   Optoquina S. pneumoniae Halo de >/= 12 mm

   ONPG E. coli Amarillo. Positivo

   ONPG Proteus sp Incoloro. Negativo

   Ehrlich E. coli Anillo rojo. Indol positivo

   Ehrlich K .pneumoniae Incoloro. Indol negativo

   Cloruro férrico Proteus sp Verde. Fenilalanina positivo

   Cloruro férrico E. coli Incoloro. Fenilalanina negativo

   REACTIVO MICROORGANISMO REACCION ESPERADA

   Sobres de Anaerobiosis Bacteroides sp Crecimiento en Anaerobiosis

   Suero para tubos germinales Candida albicans Tubos germinales positivo

2. CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS :
3. CONTROL DE CALIDAD DE LOS TINTES :

La clasificación correcta de las bacterias de acuerdo a las reacciones bioquímicas, dependen de la pureza, reactividad y estabilidad de los reactivos. La concentración de las soluciones por efecto de la evaporación de los solventes o las variaciones introducidas en los métodos recomendados, puede afectar los resultados de modo adverso. Este es el caso de las tinciones para diferenciar bacterias por su reacción al Gram y la morfología bacteriana, tintes para cápsulas, esporas, etc.

El control de calidad de éstos tintes debe realizarse primero con cada nuevo lote preparado; luego basta con un control cada semana para mantener un grado de seguridad apropiado en su uso.

En el caso de la tinción de Gram, sin lugar a dudas una de las herramientas más importantes del microbiólogo, se recomienda tener especial cuidado con la mezcla de alcohol-acetona para decolorar la placa. Es posiblemente éste reactivo el que produce mayores problemas ya sea por decoloración excesiva o por débil decoloración de los microorganismos. Es también la etapa de la tinción de Gram en la que el tiempo de exposición es más determinante.

Para facilitar el control de los tintes, se recomienda preparar placas con microorganismos aislados en el trabajo rutinario, utilizando cepas frescas, tomando en cuenta aquellos que pudieran ser más útiles según la tinción a evaluar.

Algunos ejemplos son :

TINCION MICROORGANISMO REACCION ESPERADA

Gram Estafilococo sp Morado. Gram-Positivo.

Gram E. coli Rosado. Gram-Negativo.

Gram Mezcla de ambos Mezcla de ambas colores.

Zielh-Neelsen Mycobacterium sp Rosadas. BAAR positivo

Zielh-Neelsen E. coli Azul. BAAR negativas.

Kellung S. pneumoniae Detección de cápsula positiva

Kellung E. coli Detección de cápsula negativa

Verde malaquita Clostridium sp Espora de color verde.

Resto de la célula rosada.

Verde malaquita E. coli Célula completa rosada.

ALGUNAS CAUSAS DE ERROR DURANTE LA TINCION :

1. El Violeta Cristal tiende a hacer precipitación, lo cual puede ser causa de observación de estructuras ficticias en el frotis. Si se observa precipitación, proceda a filtrar el tinte.
2. La evaporación puede ser causa de mal funcionamiento de los tintes.
3. Las placas que no han sido previamente limpiadas o con restos de grasa, pueden ser causa de mala fijación y tinción de la muestra .
4. Sobrecalentamiento de la placa durante la fijación. El exceso de calor provoca un daño físico en la pared celular de las bacterias que puede afectar la retención de los colorantes.
5. Lavado muy fuerte de la placa durante la tinción.
6. Proporción no adecuada de los componentes de la tinción.
7. Algunos tintes como Safranina y Fucsina básica pueden contaminarse. Si se sospecha esto , cultive 1 ml en Tioglicolato, o descarte el tinte.
8. La tinción de Zielh-Neelsen tiene sus limitaciones en cuanto a no ser específica para micobacterias y su baja sensibilidad, ya que el nivel de detección es de 5,000 a 10,000 bacilos por mililitro de esputo. Esto debe ser tenido en cuenta al evaluar una placa.
9. Una Cepa Control positiva, debe ser teñida cada vez que un nuevo lote de tintes para Zielh-Neelsen es preparado y cuando se reciba un nuevo pedido de tintes y reactivos. Se puede utilizar la cepa de Mycobacterium tuberculosis ATCC 25177 como control positivo.

1. CONTROL DE CALIDAD DE ANTISUEROS :

El mundo de la microbiología ha sido inundado cada vez más por productos comerciales hechos con el objetivo de detectar agentes etiológicos de enfermedades en el menor tiempo posible, con el mayor grado de especificidad , sensibilidad y algunos de ellos con la intención de eliminar el cultivo bacteriano como única forma diagnóstica. Estos sistemas actúan algunos con solo la muestra del paciente y otros requieren de la cepa aislada o detectan sus metabolitos. Estos sistemas se han convertido en un arma imprescindible para el microbiólogo y en muchos casos dan confianza en la seguridad del diagnóstico y en otras se utilizan en la detección de microorganismos difíciles de cultivar.

Estos productos para la detección directa del espécimen o la cepa bacteriana, son considerados exámenes bacterianos y no test serológicos. En forma general éstos kit deben ser probados cada vez que se recibe un nuevo lote y cada vez que se utilicen, se le deben correr sus controles positivo y negativo que vienen con cada kit.

CONSIDERACIONES GENERALES EN EL USO DE ANTISUEROS :

1. Los sistemas son para uso exclusivo de diagnóstico in vitro.
2. Conservar todos los reactivos en refrigeración.
3. Anotar la fecha en que se abre el kit.
4. No congelar los reactivos.
5. No utilizar los reactivos si se sospecha deterioro de los mismos, tales como si se observa cambio de color, autoaglutinación en el envase, no producen la reacción esperada con los controles respectivos, reactivos contaminados o con signos de evaporación.
6. El personal de laboratorio calificado, debe utilizar las técnicas asépticas y las precauciones habituales para protegerse de los agentes infecciosos.
7. Nunca pipetear con la boca las muestras y/o los reactivos.
8. No utilizar reactivos de lotes diferentes.
9. No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad.
10. Después de sacar los reactivos de la refrigeradora, dejarlos a temperatura ambiente antes de utilizar.
11. Todos los productos inoculados deben ser considerados como potencialmente infecciosos.
12. No volver a utilizar las tarjetas desechables , después de haber sido utilizadas.
13. Algunas pruebas deben estar precedidas por su apropiado cultivo, aislamiento y pruebas bioquímicas preliminares, antes de realizar métodos serológicos y una identificación final.
14. Al terminar la prueba, todo el material sucio y productos inoculados deben ser sometidos a esterilización por autoclave, incinerados o sumergidos en un desinfectante germicida adecuado, antes de su eliminación.
15. La interpretación de los resultados debe ser hecha por personal calificado, que tomará en cuenta el contexto clínico, el origen de la muestra, los aspectos macro y microscópico y su experiencia.
16. Aglutinación por Antígenos de Estreptococos :

• Un test positivo está indicado por la aparición de una aglutinación nítida de látex en 2 minutos en un círculo, lo cual permite la identificación de grupo.
• No tomar en cuenta las aglutinaciones débiles que pudieran aparecer en otros círculos.
• Una aglutinación intensa en varias suspensiones de látex, representa una mezcla de grupos o una cepa autoaglutinable. Volver a hacer el aislamiento de la colonia y el test de látex.
• Una vez a la semana verificar la reactividad de las suspensiones bacterianas. Para ello seguir las indicaciones del fabricante y reemplazar la cepa a analizar , por el control positivo. Debe aparecer una aglutinación en cada suspensión látex.
• También la especificidad del test se puede analizar utilizando cepas control como el Streptococcus pyogenes ATCC 19615 ó seguir la técnica sin emulsionar colonias en la enzima de extracción, o mezclar los reactivos de látex con una gota de NaCl 0.15 mol/l. No debe aparecer aglutinación en las suspensiones de látex.
• Pueden aparecer resultados falsamente negativos si se estudia una cantidad insuficiente de colonias
• Cuando se utiliza el método de detección directa de antígenos en muestras del tracto respiratorio superior, hay que tener en cuenta la baja sensibilidad del test, por lo que todo resultado negativo debe ser seguido por su correspondiente cultivo para verificar.

17) Detección de antígenos asociados a meningitis bacteriana :

• El antígeno de N.meningitidis grupo B es más difícil de detectar, ya que está relacionado estructural e inmunologicamente con el antígeno de E.coli K1. Por ello una reacción positiva con éste antisuero en LCR de recién nacido o prematuro, indica en la mayoría de los casos la presencia de E.coli K1. En un sujeto de más edad, si puede indicar la presencia de N. meningitidis grupo B.
• La sensibilidad de éste látex de aglutinación tiene un rango entre 65% para

S. pneumoniae y 95% para H. influenzae.

• Como otras pruebas de látex, un valor positivo depende del nivel de antígenos detectable. Este es un test de descarte, que no reemplaza al cultivo.
• Cada laboratorio debe evaluar la sensibilidad, especificidad y valor predecible para su población de pacientes.

18) Aglutinación por Salmonella sp :

• Sea estricto en el tiempo de la reacción.
• Miembros del grupo Salmonella están antigénicamente relacionados a

Citrobacter y Arizona. Antígenos de éstos microorganismos tienen estructuras compartidas, por lo que puede haber reacciones cruzadas.

Por esto es importante que la prueba de aglutinación por Salmonella solo se realice a aquellas cepas que muestran patrón bioquímico del género Salmonella.

5. CONTROL DE CALIDAD DE LA PRUEBA DE SENSIBILIDAD

A LOS ANTIBIÓTICOS MEDIANTE DISCO:

Hemos querido resaltar los aspectos de control de calidad de la prueba de sensibilidad a los antibióticos por difusión simple en agar, utilizando discos de sensibilidad, ya que es la prueba de mayor utilidad en nuestro medio.

Es importante tener presente que ésta prueba a sido designada exclusivamente para examinar microorganismos de rápido crecimiento, utilizando la normativa

NCCLS M2-A6 , volumen 13, número 24.

Este método no es útil para organismos fastidiosos, de crecimiento lento o para anaerobios.

El método de difusión simple en agar es sin lugar a dudas el sistema de mayor uso para la realización de la sensibilidad bacteriana. Hay que tener en cuenta el gran valor de ésta prueba en la detección temprana de multiresistencia, escogencia y valoración de un antibiótico frente a un microorganismos patógeno, protección de infección, estudios epidemiológicos, etc .

La prueba de sensibilidad a los antibióticos consta de varios elementos que deben ser tenidos en cuenta: El medio de cultivo, inoculo, incubación, lectura e interpretación y el reporte.

1. Control de calidad del medio de cultivo:

1. Utilizar agar de Mueller-Hinton.
2. La calidad del agua es determinante, ya que la misma debe estar libre de iones metálicos. Las variaciones de cationes divalentes, principalmente calcio y magnesio, afectará los resultados con aminoglicósidos, tetraciclina y colistina, cuando se prueban ante cepas de Ps. Aeruginosa. Un contenido excesivo en catión, reducirá la zona de inhibición, mientras que un escaso contenido en catión, puede dar un inaceptable aumento en el tamaño de la zona.

   100 x 15 mm, con una profundidad de 4 a 5 mm

3. Servir en platos Petri grandes de 150 x 15 mm preferiblemente o
4. Aproximadamente se utilizan 25 cc para platos de 100 mm y 60 cc para

platos de 150 mm.

5. Volúmenes mayores de medio provocan disminución en el tamaño del

halo de inhibición, y volúmenes menores halos más pequeños.

6. Se deben seguir las normas generales establecidas para almacenamiento

del medio de cultivo.

7. Los platos Petri deben ser colocados en la incubadora para secarlos de

restos de agua producto de la condensación, antes de ser utilizados para

no diluir el inoculo bacteriano.

1. Control de calidad de los discos de sensibilidad:

Las metas de un programa de control de calidad van destinadas a monitorear:

La precisión y exactitud del procedimiento de la prueba de susceptibilidad, el comportamiento de los reactivos utilizados en la prueba y la actuación de las personas que llevan a cabo las pruebas y sus resultados.

1. Los discos deben ser almacenados a un temperatura entre –20 y +8°C.

2. Algunos discos, especialmente los de antibióticos ß-lactámicos deben guardarse congelados a -20°C. Solo los viales en uso deben mantenerse a temperatura de refrigeración.

   alcancen la temperatura ambiente por 1 a 2 horas.

3. Al sacarlos de la refrigeradora para su uso, espere a que los viales
4. Siempre utilice primero los viales con fecha de caducidad más próxima.
5. Siempre que un cartucho a sido extraido del paquete, éste debe guardarse en un desecador que cierre perfectamente.
6. Cuando se utilice el aparato dispensador que contiene los discos deberá mantenerse siempre refrigerado.

   100 mm.

7. Los discos son colocados en el medio a una distancia de más de 24 mm del centro de uno al centro del otro. En todo caso no colocar más de 12 discos en una placa de 150 mm, ni más de 5 discos sobre la placa de

   Cefalosporinas, Aminoglicósidos, Vancomicina ) al lado de antibióticos bacteriostáticos ( Ej. Cloranfenicol, Tetraciclina, Sulfonamidas ) para evitar el antagonismo antibiótico.

8. Procurar no colocar discos de antibióticos bactericidas ( Ej. Penicilina,

   después de su aplicación.

9. Colocar las placas en la incubadora dentro de los 15 primeros minutos
10. Para verificar el estado de los discos de sensibilidad, utilice cepas control ATCC, las cuales son seleccionadas por su estabilidad genética y por su utilidad en el método utilizado. Estas cepas se corren como una muestra más y se correlaciona el tamaño de los halos de inhibición con las medidas expresadas en los Manuales NCCLS M2-A6.

Entre las cepas ATCC ( American Type Culture Collection ) recomendadas están:

Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

Haemophilus influenzae ATCC 49247 y 49766

Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226

Escherichia coli ATCC 25922 y 35218

( La E coli 35218 como organismo de control para combinaciones con inhibidor de betalactamasa, como aquellos que contienen ácido clavulánico, sulbactam o tazobactam ).

Staphylococcus aureus ATCC 25923 y 29213

Pseudomona aeruginosa ATCC 27853

Enterococcus faecalis ATCC 29212

( Para ser utilizado con discos de alto contenido de Aminoglicósidos ).

EL ESTANDAR McFARLAND :

• La densidad de la turbidez del Estándar McFarland deberá ser verificada utilizando un espectrofotómetro con dirección de luz de 1 cm y cubetas adecuadas para determinar absorbancia. Para realizar el control de un estándar McFarland de 0.5 , la absorbancia deberá leer entre 0.08 a 0.10

a una longitud de onda de 625 nm.

• La suspensión de Sulfato de Bario deberá transferirse en alícuotas de 4 a 6 ml dentro de tubos con rosca. Estos tubos deberán guardarse a temperatura ambiente en un lugar fresco y oscuro.
• Antes de ser usados, los patrones deberán agitarse para una adecuada homogenización.
• Mensualmente los patrones son descartados y vueltos a preparar, o en su defecto se debe comprobar su densidad.

Habituales causas de error en la prueba con disco:

1. Error administrativo en la transcripción de los datos del control de calidad.
2. Lectura errónea al medir el diámetro de la zona.
3. Contaminación u otros cambios en la cepa control.
4. Suspensión del inóculo demasiado fuerte o demasiado débil.
5. Mala agitación del estándar McFarland o estándar dañado.
6. Incorrecta temperatura, tiempo o atmósfera de incubación.
7. Perdida de la potencia del disco durante su transporte, su manejo o su almacenaje en el laboratorio.

3) Control de calidad de la lectura e interpretación:

1. Penicilina, utilizar un disco de Oxacilina de 1 µg.

   Las cepas de S. Pneumoniae con zonas de Oxacilina de >/- a 20 mm

   son susceptibles a penicilina ( CIM </- 0.06 µg/ml ).

2. Cuando se va a determinar la sensibilidad del S. Pneumoniae a la

   Resistencia a Oxacilina y Meticilina de los Estafilococos. Esto se debe a que la Oxacilina es más resistente a la degradación durante el almacenaje y porque es más probable que detecte a las cepas heteroresistentes de Estafilococo.

3. Se recomienda utilizar un disco de Oxacilina de 1 µg para probar

   ( MRSA), deben incubarse a 35° C por 24 horas exactas.

4. Las pruebas para detectar Estafilococos Meticilina Resistentes

   resistentes a todos los Cefems y otros betalactámicos, así como Ampicilina/ácido clavulánico, Ampicilina/Sulbactam, Ticarcilina/ácido clavulánico, Piperacicilina/Tazobactam e Imipenem, independiente de los resultados in vitro con dichos agentes.

5. Los Estafilococos meticilina resistentes deberán informarse como

   Las placas han de leerse con luz transmitida para visualizar cualquiera

   pequeña colonia dentro del halo, que haría la cepa resistente.

6. Los Enterococos pueden ser resistentes a Penicilina y a Ampicilina debido al desarrollo de poca afinidad de las proteínas fijadoras de penicilina ( PBP’s) o a la producción de betalactamasa. Las pruebas de difusión en disco pueden detectar con exactitud los aislamientos que poseen alteradas las PBP’s , pero no detectarán con fiabilidad las cepas productoras de betalactamasa. Estas últimas han de detectarse con pruebas directas de betalactamasa ( Ej. Cefinasa ).

   confirmado, enviado a un laboratorio de referencia e informar a las

   Autoridades de Salud Pública.

7. Todo caso de Estafilococo resistente a la Vancomicina, debe ser
8. Cuando se trata de Sulfonamidas, los microorganismos deben desarrollarse por varias generaciones antes de que ocurra inhibición, por lo que se hace caso omiso del crecimiento leve, al igual que de un vestigio de proliferación dentro del halo de inhibición.
9. Si se observan colonias dentro de un halo de inhibición, deberá confirmarse la pureza de la cepa y repetir la prueba.
10. La difusión ( " swarming ") de los Proteus sp no es inhibida por todos los antibióticos, por lo que no se toma en cuenta.
11. Ocasionalmente se pueden observar varis colonias esparcidas por una zona de inhibición. Este fenómeno es constante para la Serratia sp y la Polimixina. Las colonias se considerarán significativas y la cepa resistente
12. Solo es necesario probar una Tetraciclina y sus resultados son equivalentes a la Tetraciclina, Minociclina, Doxiciclina.
13. Los resultados obtenidos con al Polimixina, pueden aplicarse a la Colimicina. Su halo es pequeño debido a su pobre difusión en agar.

    de sensibilidad falsos con discos de Cefprozil , las cepas de éste género

    no deben analizarse ni informarse con éste disco.

14. Se ha informado que algunas cepas de Providencia sp dan resultados
15. Los Estafilococos resistentes a la Meticilina, Oxacilina o Nafcilina, también puede ser informados como resistentes a la Penicilina, Cefalosporinas , carbapenem y combinaciones de inhibidores de betalactamasa, a pesar de su aparente sensibilidad in vitro, lo cual no se refleja in vivo.
16. La Cefalotina puede utilizarse para representar Cefalotina, Cefradina Cefaclor y Cefadroxil
17. Los datos de sensibilidad al ácido nalidíxico, Nitrofurantoina, Norfloxacina, Sulfonamidas y Trimethoprim, se aplican solamente a cepas aisladas de infecciones urinarias.
18. El disco de Sulfisoxazol puede ser usado para representar cualquiera de las Sulfonamidas disponibles.
19. En cepas de Salmonella y Shigella, solo Ampicilina, una Quinolona y Trimethoprim/sulfametoxazol deben ser probados e informados de rutina en heces. Además el Cloranfenicol y una cefalosporina de tercera generación deben ser probados e informados en cepas de Salmonella sp extraintestinal.
20. En cepas de Salmonella sp y Shigella sp, los aminoglicósidos y las cefalosporinas de primera y segunda generación, pueden aparecer como activos in vitro pero no son efectivos clínicamente y no deben ser informados como susceptibles.
21. La prueba de la betalactamasa predice la resistencia a la Penicilina, Ampicilina y Amoxicilina.
22. Las cefalosporinas pueden aparecer activas in vitro contra Listeria sp, pero no son efectivas clínicamente y no deben ser informadas como susceptibles.
23. Los Enterococos sp las cefalosporinas, los aminoglicósido ( Excepto por resistencia de nivel alto ), Trimethoprim/sulfametoxazole y la Clindamycina, pueden aparecer activos in vitro pero no son efectivos clínicamente y éstas cepas no deben informarse como susceptibles.
24. La susceptibilidad y resistencia a Azitromicina, Claritromicina y Diritromicina puede ser interferida por la prueba de Eritromicina.
25. Solo los resultados de las pruebas de Ampicilina, una cefalosporina de tercera generación, el Cloranfenicol y Meropenem deben ser informados de rutina en todas las cepas aisladas de H. influenzae aisladas de sangre y LCR de pacientes con infecciones severas.
26. Los resultados de las pruebas de susceptibilidad con Penicilina, Cefotaxime o Ceftriaxone, Meropenem y Vancomicina, deben ser informados de rutina en cepas de S. pneumoniae aisladas de sangre y LCR de pacientes con infecciones severas como meningitis y bacteremia.

Verificación de antibiogramas atípicos :

1. Examine primero por errores de trascripción.
2. Reexamine el plato de sensibilidad.
3. Evalué reportes previos del paciente para observar su patrón de sensibilidad anterior.
4. Repita los test de identificación y sensibilidad a los antibióticos.

Condiciones sugeridas que requieren verificación del resultado de

Sensibilidad a los antibióticos :

1. S. aureus resistente a Oxacilina.
2. S. pneumoniae resistente a Penicilina.
3. Cefalosporinas de amplio espectro ( Cefotaxime, Ceftriaxone ) resistente a S. pneumoniae.
4. Streptococcus viridans penicilina resistente o intermedio, aislados de áreas estériles del cuerpo.
5. Estafilococos o Enterococos resitentes a la Penicilina o intermedio.
6. Enterococos con altos niveles de resistencia a la Gentamicina aislados de áreas estériles del cuerpo.

   ( Ej. Resistente a Ceftazidime ).

7. Klebsiella sp o E. coli con potencial espectro de betalactamasa.

   Tobramicina-Amikacina.

8. Bacilos Gramnegativos no fastidiosos resistentes a Gentamicina-
9. S. maltophilia resistente a Trimethoprim-Sulfametoxazole.
10. H. influenzae Ampicilina resistente y betalactamasa negativa.
11. Un aislamiento para el cual el antibiograma es atípico para la especie.

    Citrobacter freundii, Serratia marcescen y Ps. Aeruginosa.

12. Ampicilina y/o Cefalotina susceptible para Enterobacter sp,
13. Klebsiella sp sensible a Ampicilina.

    S. maltophilia.

14. Bacilos Gramnegativos Imipenem resistentes o intermedio, excepto
15. Bacilos Gramnegativos Ciprofloxacina resistente, excepto

S. maltophilia o B. cepacia.

3. Control de calidad de la sensibilidad a los antibióticos

en los sistemas computarizados :

Los Laboratorios de Microbiología modernos tienen a su alcance una creciente gama de sistemas computarizados para la identificación de los microorganismos y su susceptibilidad a los antibióticos. Algunos de estos sistemas traen consigo programas de computadora para ayudar a evaluar el control de calidad de los mismos. En algunos casos, la computadora hace un control periódico de su funcionamiento mediante comandos u ordenes preestablecidas.

Debido a que en nuestro medio existe solamente el Sistema Vitek de identificación microbiana, solo haremos algunas observaciones relativas a éste sistema.

El Sistema Vitek utiliza una determinación turbidimétrica de la rapidez de crecimiento del microorganismo, en presencia de agentes antimicrobianos para obtener un análisis de regresión lineal y posteriormente determinar un algoritmo derivado de la concentración inhibitoria mínima ( CIM ).

Actualmente el laboratorio cuenta con un grupo limitado de tarjetas Vitek para la sensibilidad a los antibióticos, tal como sigue:

1. Sensibilidad de los Gramnegativos:

1. GNS : Para uso en Policlínicas y área hospitalaria.

1. GNS-PA : Para uso hospitalario – Cuidados intensivos.
2. GNS-GD : Uso hospitalario – Líquidos corporales
3. GNS-OP : Uso exclusivo para urocultivos.

1. Sensibilidad de los Grampositivos:

1. GPS-SA : Para Estafilococos y bacilos Grampositivos.

2. GPS-TA : Para Estreptococos, inclusive Enterococos.

Al hacer el control de calidad de las tarjetas de sensibilidad a los antibióticos, se recomienda utilizar cepas ATCC con CIM conocidas. Estas pruebas se pueden realizar una vez al mes durante 10 días seguidos, en los cuales se aceptan no más de 2 valores de CIM para cada combinación de Antibiótico/Organismo fuera del rango establecido.

Si se diera el caso de deben correr controles de calidad con cepas ATCC durante 30 días consecutivos, en los cuales no se aceptan más de 3 valores fuera de rango. Si los hay, llamar al Departamento de Servicio de Vitek para el chequeo correspondiente.

Para realizar los controles se recomiendan las siguientes cepas ATCC para las tarjetas respectivas:

TARJETA CEPAS ATCC

GNS E. coli ATCC 25922 / Ps. aeruginosa ATCC 27853

E. faecalis ATCC 29212

GNS-PA E. coli ATCC 25922 / Ps. aeruginosa ATCC 27853

TARJETA CEPAS ATCC

GNS-GD E. coli ATCC 25922 / Ps. aeruginosa ATCC 27853

E. coli ATCC 35218 / E. faecalis ATCC 29212

GNS-OP E. coli ATCC 25922 / Ps. aeruginosa ATCC 27853

E. coli ATCC 35218 / E. faecalis ATCC 29212

GPS-SA E. faecalis ATCC 29212 / S. aureus ATCC 29213

E. coli ATCC 35218

GPS-TA E. faecalis ATCC 29212 / S. aureus ATCC 29213

Las tarjetas de sensibilidad a los antibióticos del Sistema Vitek, han sido comparado con los estándares de la NCCLS, mediante las técnicas de microdilución para obtener la CIM; sin embargo, bioMérieux Vitek recomienda la utilización de métodos alternos para confirmar la susceptibilidad a ciertos microorganismos contra drogas específicas.

TARJETA ANTIBIOTICO MICROORGANISMO

GNS Ampicilina A. lwoffii, Aeromona sp, Citrobacter sp

GNS Carbenicilina Acinetobacter lwoffii

GNS Cefoxitin A. lwoffii, Aeromona sp.

GNS Cefalotina Aeromona sp

GNS Trimeth/Sulfa A. lwoffii, Aeromona sp

GNS-PA Ceftazidime A. jejunii, A. lwoffii

GNS-PA Imipenem Aeromona sp

GNS-PA Mezlocilina Aeromona sp

GNS-PA Piperacilina A. jejunii, A. lwoffii

Aeromona sp , Ps. aeruginosa

GNS-PA Ticarcilina A. jejunii, A. lwoffii, Aeromona sp

GNS-GD Ampicilina A. jejunii, A. lwoffii,

Aeromona sp, Citrobacter sp

GNS-GD Cefazolina Aeromona sp

GNS-GD Cefoxitina A. jejunii, A. lwoffii, Aeromona sp

GNS-GD Imipenem Aeromona sp

GNS-GD Piperacilina A. jejunii , A. lwoffii,

Aeromona sp, Ps. aeruginosa

TARJETA ANTIBIOTICO MICROORGANISMO

GNS-GD Ticarcilina/Acido clavulánico Aeromona sp, Ps. aeruginosa

GNS-GD Trimetho/Sulfametoxazole A. jejunii, A. lwoffii, Aeromona sp

GNS-OP Acido nalidíxico Pseudomona sp ( diferente a Ps. aeruginosa)

GNS-OP Ampicilina A. jejunii, A. lwoffii,

Aeromona sp, Citrobacter sp

GNS-OP Carbenicilina A. jejunii , A. lwoffii

GNS-OP Cefalotina Aeromona sp

GNS-OP Ceftriaxone Klebsiella sp

GNS-OP Norfloxacina Acinetobacter sp

GNS-OP Trimetho/Sulfametoxazole A. jejunii, A.lwoffii, Aeromona sp

GPS-SA Eritromicina Enterococcus sp, Estreptococos grupo D

GPS-SA Tetraciclina Estafilococos coagulasa negativa,

Enterococcus sp, Estreptococos grupo B,

Estreptococos grupo D.

GPS-SA Vancomicina Enterococcus sp.

GPS-TA Cloranfenicol Staphylococcus sp

GPS-TA Eritromicina Estafilococos coagulasa negativa,

Enterococcus sp, Estreptococos grupo B,

Estreptococos grupo D

GPS-TA Vancomicina Enterococcus sp

Existe un grupo de microorganismos en que se desconoce la capacidad de las tarjetas de sensibilidad para detectar resistencia a antibióticos específicos, debido a que las cepas resistentes no estaban disponibles en el momento de realizar los test comparativos. Entre ellos tenemos :

TARJETA ANTIBIOTICO MICROORGANISMO

GNS Amikacina Aeromona sp

GNS Cefalotina A. lwoffii

GNS Gentamicina Aeromona sp

GNS Tetraciclina A. lwoffii

GNS Tobramicina Aeromona sp

GNS-PA Amikacina Aeromona sp

GNS-PA Aztreonam A. jejunii, A. lwoffii, Aeromona sp

GNS-PA Ceftazidima Aeromona sp

TARJETA ANTIBIOTICO MICROORGANISMO

GNS-PA Ciprofloxacina Aeromona sp

GNS-PA Gentamicina Aeromona sp

GNS-PA Tobramicina Aeromona sp

GNS-GD Cefazolina A. jejunii, A. lwoffii

GNS-GD Cefotaxime A. jejunii, A. lwoffii,

Aeromona sp, Citrobacter sp

GNS-GD Ciprofloxacina Aeromona sp

GNS-GD Gentamicina Aeromona sp

GNS-GD Tobramicina Aeromona sp

GNS-OP Acido nalidíxico A. jejunii, A. lwoffii

GNS-OP Amoxicilina/Acido clavulánico A. jejunii, A. lwoffii

GNS-OP Cefalotina A. jejunii, A. lwoffii

GNS-OP Ceftriaxone Aeromona sp

GNS-OP Ciprofloxacina Aeromona sp

GNS-OP Nitrofurantoina A. jejunii, A. lwoffii, Aeromona sp

GNS-OP Norfloxacina Aeromona sp

GNS-OP Tetraciclina A. jejunii, A. lwoffii

GPS-SA Penicilina y Ampicilina Enterococcus sp : Utilizar Betalactamasa

GPS-TA Penicilina y Ampicilina Enterococcus sp : Utilizar Betalactamasa

CONSIDERACIONES GENERALES:

1. Se debe tener especial cuidado en la preparación del inóculo. Fallas en su preparación, tienen efecto sobre el funcionamiento de todo el instrumento.
2. Siempre tener presente que el sistema no puede examinar todos los grupos relevantes de bacterias.
3. El uso de colonias absolutamente aisladas es clave en el aprovechamiento de los sistemas computarizados.
4. Algunos de los organismos sugeridos por el fabricante para control de calidad, podrían no detectar deterioro en el instrumento o la calidad de los reactivos.
5. Es relevante utilizar métodos alternos de sensibilidad a los antibióticos en aquellos casos en que la literatura que acompaña las tarjetas indique que el sistema falla en detectar resistencia.

   Tal es el caso de algunos bacilos Gramnegativos que inducen resistencia mediada por ß-lactamasa a algunos antimicrobianos enzimáticamente lábiles a la ß-lactamasa, como ocurre con el Citrobacter freundii, Enterobacter sp, Serratia sp, Morganella morganii, Providencia sp y Ps. aeruginosa.

6. Se han reportado casos de falsa sensibilidad o resistencia, particularmente debido al lector del instrumento o a un corto periodo de incubación durante la prueba de sensibilidad. Un periodo de 3.5 a 6 horas podría no ser adecuado para expresar todos los mecanismos de resistencia de las bacterias.
7. Se ha observado una falsa resistencia a Aztreonam, especialmente por Proteus y Morganella sp por problemas de detección fotométrica del crecimiento.
8. Se han reportado falsa resistencia a Imipenem para varias especies en periodos largos y cortos de incubación. Esto no es común y se debe a la degradación del antibiótico o la concentración de Zinc en el medio.
9. Una baja o moderado nivel de resistencia a la Vancomicina frente a Enterococcus sp se ha detectado, especialmente del tipo VanB, ya que podría no ser detectado en periodos cortos de incubación.
10. Se han observado o problemas en la detección de resistencia a altos niveles de Gentamicina o Estreptomicina frente a Enterococcus sp en incubaciones largas y cortas.
11. Tener presente colocar las marcas externas en la tarjeta, antes de meterla a la incubadora/lector.
12. No deje pasar más de 15 minutos después de prepara el inóculo, para llenar las tarjetas y colocarla en la incubadora.
13. Chequear la solución salina por esterilidad. Para ello inocule en caldo de cultivo e incube a 35°C por 24 horas.
14. Con cada lote de preparación de inóculo, estandarizar primero el calorímetro.
15. Haga que el Departamento de Servicio técnico de Vitek revise periódicamente el lector del aparato para calibrarlo.
16. Lleve un récord de cualquier discrepancia en la identificación de cepas estándar de control. Igualmente el tipo de tarjeta, lote, fecha de expiración, etc.

PATRON DE RESISTENCIA ESPERADA PARA ALGUNOS

MICROORGANISMOS:

MICROORGANISMO RESISTENCIA ESPERADA

Citrobacter, Enterobacter, Ampicilina

Klebsiella, Morganella,

Providencia, Proteus vulgaris,

Proteus penneri, Serratia,

Yersinia.

Citrobacter freundii, Enterobacter, Cefazolin, Cefalotina

Morganella, P. Vulgaris, P. penneri,

Providencia, Serratia, Yersinia.

Klebsiella Ticarcilina

C. freundii, Enterobacter, Serratia. Cefoxitin, Cefotetan

C. freundii, Enterobacter, Cefuroxime

P. vulgaris, Serratia.

MICROORGANISMO RESISTENCIA ESPERADA

Citrobacter, Enterobacter, Serratia. Amoxicilina/ácido clavulánico

Ampicilina/Sulbactam

Acinetobacter baumannii, Ampicilina, Cefazolin,

Burkholderia cepacia, Cefalotina, Cefoxitin, Cefotetan,

Ps. aeruginosa, Aeromonas, Cefmetazole.

Stenotrophomonas maltophilia.

Acinetobacter baumannii Ticarcilina, Mezlocilina, Piperacilina.

B. cepacia, S. maltophilia, Gentamicina

S. maltophilia Imipenem, Meropenem.

Ps. aeruginosa Trimethoprim-Sulfametoxazole.

6. CONTROL DE CALIDAD DE EQUIPOS Y MATERIALES DE

TRABAJO:

Objetivo: Todos los instrumentos utilizados en el laboratorio clínico, deben estar amparados por un programa de control de calidad y de mantenimiento preventivo, basados en las instrucciones del fabricante y los procedimientos establecidos.

Programa de mantenimiento: Un programa de mantenimiento preventivo es esencial para asegurar la exactitud y longevidad del instrumento. El chequeo periódico recomendado es importante para minimizar el daño o la necesidad de servicio y reparación. El Director del laboratorio es responsable por el programa general, recayendo en el jefe de la sección la responsabilidad primaria en su área de trabajo.

Puede en algunos casos relegar la responsabilidad en el Departamento de Biomédica de la institución quienes coordinarán con la casa suplidora el programa de mantenimiento.

Manual Estándar de Procedimientos Operacionales: El Manual Estándar de Procedimientos Operacionales debe ser organizado por grupo de equipos.

Un listado de los equipos debe incluir: nombre, marca, modelo, número de serie, fecha de recibo y número de inventario de la institución.

Los nuevos equipos requieren una inspección previa de Biomédica para garantizar su funcionabilidad y seguridad eléctrica.

El Manual debe incluir el récord de mantenimiento preventivo, periodicidad de la inspección y fallas del instrumento.

El Manual debe estar accesible en todo momento.

Validación de Equipos : Los nuevos equipos de mayor impacto en el cuidado del paciente ( Vitek, Bactec, BacT/alert) requieren estudios de validación para determinar que su funcionamiento es al menos comparables a los equipos existentes o a métodos de referencia. Estos equipos son aceptados solo si logran cumplir las metas mínimas de funcionabilidad y eficiencia al compararse con los existentes.

Este récord de validación debe mantenerse por toda la vida útil del equipo.

Manual de Instrucciones del Uso del Instrumento: Estos Manuales deben estar incluidos en el Manual de Operaciones del instrumento, redactados en forma clara, en el idioma de los usuarios, inclusive la documentación del entrenamiento del personal.

Cada protocolo debe incluir precauciones de seguridad y los procedimientos de limpieza y cuidado del instrumento. Los Manuales deben incluir instrucciones básicas para resolver problemas menores y un récord de incidencias, que incluye el tipo de problema, los pasos tomados para resolverlo y la acción correctiva para evitarlo en el futuro.

Calibración del Instrumento : Los equipos que requieren un exacto nivel de precisión para obtener un resultado seguro, requieren de una calibración periódica. La fecha de la calibración, frecuencia y resultado, deben ser mantenidos en un libro récord dentro del laboratorio.

Control de Calidad: Todo equipo debe ser evaluado por un programa de Control de Calidad en base a las instrucciones del proveedor y las regulaciones internas del laboratorio. Debe mantenerse un libro récord de todo lo realizado al respecto, con el nombre del instrumento, fecha, resultado y comentarios. En otro capítulo se afianzarán los conceptos sobre éste tema.

Referencias y Lectura Suplementaria: El Laboratorio guardará en un fólder toda literatura extra que se obtenga sobre un equipo, sus accesorios, materiales, estudios foráneos sobre su funcionamiento, etc.

a) INCUBADORAS:

1. Controle diariamente la temperatura de las incubadoras , antes de sacar los platos y anote en una hoja control el resultado.
2. Observe el termoregulador por cualquiera alteración en su posición preestablecida.
3. Coloque las muestras, platos y tubos, en una posición segura.
4. Un papel de filtro humedecido con agua en el fondo de la incubadora, es adecuado para mantener la humedad requerida.
5. Las incubadoras de CO2 requieren medir el nivel de gas diariamente.
6. El jefe de sección debe ser notificado cuando una incubadora falla en mantener el rango de temperatura aceptable.
7. Observe macroscópicamente los platos Petri para observar desecación.
8. En incubadoras de CO2 , se puede colocar un cultivo de N. Gonorrhoeae ATCC 43069 , subcultivandola cada día, para observar su óptimo crecimiento, ya que es un microorganismo que necesariamente requiere CO2 para crecer.
9. Todas las incubadoras deben ser limpiadas mensualmente y llevar un récord de mantenimiento preventivo.

b) AUTOCLAVES :

Procedimiento Por corrida Diario Semanal Mensual

1. Examine récord de Temperatura y Presión X

2. Utilice Indicadores de Esterilización X

3. Récord de uso, fecha, temperaturas, presión X

4. Chequeo del nivel de agua X

5. Uso de Indicadores biológicos de Esterilidad X

6. Chequeo de la válvula de seguridad X

7. Limpieza del Interior y Exterior. X

8. Limpieza de la Pantalla de Temperatura X

9. Limpieza del drenaje y sellos X

c) CAMARAS DE SEGURIDAD :

1. Apague la lámpara Ultravioleta antes de comenzar a trabajar.
2. Prenda el blower 15 minutos antes de utilizar.
3. Observe que no se obstruye el flujo de aire.
4. Si hay derrame dentro de la cabina, limpie con un desinfectante apropiado, manteniendo apagada la cabina.
5. Evite el uso de mecheros de flama dentro de la cabina.
6. Lleve un control de la medida del flujo de aire.
7. Lleve un control de la calibración del flujo de aire.
8. Lleve un control del remplazo de los filtros.
9. Compruebe los sistemas de alarma de funcionamiento.
10. La superficie interior de la mesa de trabajo de la cabina, puede ser cultivada semanalmente para detectar contaminación.
11. Desinfecte la cabina antes y después de utilizar.
12. No utilice las cabinas biológicas para hacer mezclas de sustancias químicas y viceversa.
13. Cuando trabaje en la cabina, evite la entrada brusca de aire y el uso innecesario de las puertas del área.

d) INCINERADOR :

1. En condiciones normales el incinerador logra la temperatura óptima de esterilización ( 815°C ) 10 minutos después de haber sido encendido.
2. Bastan 5 segundos para lograr la destrucción de bacterias, hongos y micobacterias.
3. No es necesario observar incandescencia en el asa para lograr la esterilización.
4. Inspeccione la cerámica del incinerador por rajaduras.
5. Aleje el incinerador de elementos que puedan incendiarse por el calor generado.

e) GENERADORES DE AMBIENTE – SISTEMA GasPak

1. Mantenga los generadores de gas a temperatura ambiente y el sobre sellado.
2. Mantenga los catalizadores en lugar seco, a temperatura ambiente y las bolsas sellados.

   ( 2-8°C ).

3. Mantenga los indicadores de anaerobiosis a temperatura de refrigeración
4. El tiempo de generación de la atmósfera dentro de la jarra es de 30 minutos.
5. El indicador de anaerobiosis cambia de color azul a blanco dentro de la jarra en 4 a 5 horas.
6. Una evidencia sugestiva de ambiente anaerobio, es el cambio de color a rojo vino del agar sangre.

   ( ATCC 19402 ) como indicador de ambiente anaerobio, ya que el mismo es anaerobio estricto.

7. Algunos microbiólogos utilizan un agar inoculado con Clostridium novyi B
8. Los catalizadores de Paladio, pueden ser regenerados colocándolos en horno a 160 °C por 2 horas.
9. Control biológico de crecimiento:

CEPA ATCC RESULTADO

Cl. perfringes 13124 Crece

Micrococcus luteus 9341 No crece

Campylobacter jejuni 33291 Crece

1. Refrigeradoras :

1. Control diario de la temperatura.
2. Coloque los platos Petri en posición invertida con la tapa hacia abajo.
3. Mantenga la temperatura entre 4 – 8 ° C.
4. Utilice refrigeradoras que no hacen escarcha.
5. No coloque medios de cultivo aún ligeramente calientes dentro de la refrigeradora.
6. Evite abrir con frecuencia la puerta de la refrigeradora.
7. Lleve un registro de problemas de funcionamiento, causa y solución.
8. No guarde alimentos en refrigeradoras para especímenes clínicos.

1. Cuidados y mantenimiento Diario Mensual Semestral

   1. Limpieza del aceite de objetivos, condensador, etc X

   2. Apagar la fuente de luz X

   3. Colocar cobertor contra el polvo X

   4. Limpieza de Ocular, condensador, diafragma

   con líquido de limpieza de lentes X

   5. Limpieza y ajuste del sistema óptico X

   6. Limpieza y ajuste del sistema lumínico X

   7. Limpieza y lubricación del sistema mecánico X

   ______________________________________________________________________

2. Microscopios :
3. Centrífugas :

_____________________________________________________________________________________

Elemento / acción Por corrida Diario Semanal Mensual Anual

1. Verificar tubos por rajaduras X

2. Verificar por restos de vidrio o líquido

dentro del portatubo o las copas X

3. Verificar por balance de cada lote X

4. Verificar por la temperatura de

funcionamiento ( Refrigeradas ) X

5. Limpieza de cualquier derrame X

6. Limpieza de la olla del rotor X

7. Limpieza externa X

8. Desinfección de la olla del rotor X

9. Verificación de brochas X

10. Chequeo del circuito eléctrico X

11. Certificación del velocímetro X

12. Medición de la temperatura interna

con termómetro calibrado ( Centrífugas refrigeradas ) X

Problemas y Limitaciones:

1. 1. Chequear por balance apropiado.
   2. Chequear tamaño de los tubos.
   3. Mirar si la centrífuga está sobre una superficie plana.
2. Vibración
   1. Chequear tamaño de los tubos.
   2. Balance correcto.
   3. Verificar el interior de los portatubos
3. Rotura
4. Desprendimiento de tapas:

1. Utilice tapas de rosca.
2. Si no es posible, use Parafilm sobre los tapones de caucho.
3. Siempre que sea posible utilice tubos de plástico.

4) No centrifuge grandes volúmenes de líquidos inflamables, los cuales pueden

producir vapores que pueden incendiarse durante la operación del equipo.

1. La concentración de materiales infecciosos para cultivo puede realizarse en el área rutinaria de cultivo, siempre y cuando los tubos estén bien cerrados.
2. No colocar las tazas o los portatubos en el horno o autoclave para descontaminar.
3. Evitar utilizar para la limpieza soluciones que contengan cloro o sal, ya que son altamente corrosivas.

1. CONTROL DE CALIDAD DE EQUIPOS COMPUTARIZADOS

El laboratorio de microbiología moderno se auxilia de equipos computarizados para ayudar en la rapidez y precisión del diagnóstico etiológico. En la sección de Microbiología del Laboratorio Clínico del C.H.M,Dr. A.A. Madrid contamos hasta la fecha de 4 sistemas computarizados: BacT/Alert y Bactec para los hemocultivos, Vitek System para la identificación y antibiogramas y mas recientemente el Bactec MGIT 960 para la detección de micobacterias.

Cada uno de éstos equipos, consta de sus propios sistemas para el control de calidad. A continuación presentamos algunas observaciones relativas al control de calidad de los referidos equipos:

a) BacT/Alert:

El sistema BacT/Alert es utilizado para la detección temprana de microorganismos en hemocultivos u otros fluidos corporales. El sistema utiliza un sensor colorimétrico y una luz reflejada para monitorear la presencia y producción de CO2 disuelto en el medio de cultivo. Si existen microorganismos en la muestra, se genera CO2 cuando los microorganismos metabolizan los substratos del medio de cultivo. Si el crecimiento de los microorganismos genera CO2, el color del sensor

gas-permeable instalado en el fondo de cada frasco de cultivo cambia de verde a amarillo.

Cada equipo trae consigo un kit de reflectancia estándar para los procedimientos de control de calidad y de calibración. Además, de un software para ayudar en pantalla a realizar el mismo. A parte de esto, cada lote de frascos de cultivo es suministrado con un Certificado de Análisis de control de calidad de fábrica.

El BacT/Alert utiliza 3 determinantes de control de calidad: Control de calidad de las celdas, Calibración de las celdas y Calibración de la temperatura del equipo.

La opción Control de Calidad de las Celdas es utilizada para asegurar que las celdas del instrumento están en su óptima capacidad de detección.. Este control debe ser parte del mantenimiento normal del sistema. Un kit estándar de reflectancia es proporcionado con cada instrumento para los procesos de control de calidad y calibración. Son dos estándares de reflectancia en cada kit, sin embargo, el proceso de control de calidad solo utiliza el estándar de reflectancia B. El anillo al final de los estándares identifica su número estándar de reflectancia. Cuando el control de calidad de una celda falla y no es recalibrada, ésta automáticamente es inactivada.

Generalmente el periodo de control de calidad para cada celda está configurado en 30 días en base al menú Editar Configuración del Sistema del capítulo Mantenimiento de Funciones del Sistema. Este control solo se puede realizar en celdas vacías. Al final de que todas las celdas han sido evaluadas, puede obtenerse por impresión un Reporte del Estado de las Celdas, luego de lo cual el instrumento retorna automáticamente al menú Funciones de Mantenimiento del Instrumento.

La opción Calibración de Celdas, es utilizada para recalibrar cualquier celda que haya fallado el control de calidad. El kit viene con dos estándares de reflectancia. El procedimiento utiliza ambos. El instrumento automáticamente recalibra la celda una vez se ha introducido el estándar cuando lo indique el instrumento. Si la calibración de la celda falla, el instrumento automáticamente inactiva la celda. Al final se puede obtener un reporte del estado del instrumento y la pantalla retorna automáticamente al menú de Funciones de Mantenimiento del Instrumento.

La opción Calibración de la Temperatura, es utilizada para calibrar la temperatura dentro del instrumento. Primero se mide la temperatura interna del instrumento utilizando el proceso descrito en Verificación de la Temperatura del capítulo Mantenimiento Preventivo. Solo utilice ésta opción si hay discrepancia entre la temperatura marcada por el equipo y la temperatura óptima preestablecida.

1. En el Menú principal ir a Otras Funciones BacT/Alert.
2. Mantenimiento del Instrumento.

a1) Control de calidad.

b1) Control de calidad de celdas.

c1) Lista de Celdas

d1) Seleccionar la tecla F9

f1) Introducir los estándares de calibración de celdas siguiendo las

instrucciones de la pantalla.

a2) Calibrar celdas.

b2) Quiere calibrar la celda "x "

c2) Si

d2) Introducir el estándar I en la celda "x"

a3) Calibrar temperatura

b3) Seleccionar y ajustar la temperatura del equipo.

Observaciones y Limitaciones del Sistema:

1. En cada frasco se debe anotar su número de laboratorio y la casilla asignada.
2. Colocar los frascos hasta el fondo de la celda.
3. No aerear los frascos anaerobios.
4. Todo frasco con frotis negativo, debe ser colocado nuevamente en el aparato.

   P. anaerobius, pueden ser sensibles al anticoagulante ( SPS ) lo que resulta en una falta de crecimiento o baja producción de CO2.

5. Ciertas variantes de H. influenzae, N. Meningitidis, N. Gonorrhoeae y

   u otro suplemento al frasco si se intenta recuperar organismos tales como H. influenzae y N. gonorrhoeae.

6. En el caso de cultivo de otros fluidos corporales, se requiere agregar sangre
7. En contadas ocasiones pueden presentarse BacT/Alert positivos, con frotis y subcultivos negativos, debido a una excesiva cantidad de glóbulos blancos en la muestra de sangre.
8. Se recomienda quitar del aparato, aquellos frascos considerados positivos por el BacT/Alert, para evitar cultivos no viables debido a autolisis, especialmente en microorganismos fastidiosos como el S. pneumoniae.

1. BACTEC 9240 :

El sistema Bactec 9240 es utilizado para la detección temprana de microorganismos en hemocultivos por el método de la fluorescencia.

Cada frasco contiene un sensor que puede detectar aumentos del CO2 producido por el crecimiento de los microorganismos. Cada 10 minutos el instrumento verifica el aumento de la fluorescencia del sensor, la que se relaciona con la cantidad de CO2 presente.

Observaciones y limitaciones del Sistema:

1.. No utilice frascos con signos evidentes de deterioro.

2. No utilice frascos de cultivo después de la fecha de caducidad.
3. Los frascos inoculados deben ponerse en el instrumento tan pronto como sea posible.
4. Si se ha tardado en colocar un frasco inoculado en el instrumento, y se puede ver crecimiento, el frasco no debe analizarse en el instrumento, sino subcultivarse y hacer placa por Gram, considerándolo como un frasco presuntamente positivo.

   El control negativo está constituido por un frasco sin inocular.

5. Se recomienda analizar el rendimiento de cada lote de frascos recibidos, utilizando un control positivo y uno negativo. El frasco positivo debe inocularse con 1.0 ml de una suspensión de E. coli o S. aureus con un estándar McFarland de 0.5.

   sobre algunas Neiserias y cocos Grampositivos anaerobios, se recomienda utilizar volúmenes de sangre no menores a 1.0 ml para facilitar el crecimiento.

6. Dado que la sangre puede neutralizar la acción tóxica del anticoagulante SPS
7. Ciertos organismos exigentes como el H. influenzae requieren para su crecimiento de elementos que se encuentran en la sangre como el factor V. Si la muestra de sangre es reducida, es posible que se requiera agregar éstos suplementos al frasco si se sospecha de éstos microorganismos.
8. Puede darse casos de falso positivo en pacientes con un conteo de leucocitos muy elevado.

1. Sistema ViteK:

El control de calidad , es un subsistema del Vitek, que examina la seguridad de sus tarjetas. El control de calidad opera similarmente a la evaluación de exámenes clínicos. El test clínico identifica el organismo, el examen de control de calidad valida el test.

1. 1. El programa de control de calidad evalúa el kit del Vitek y los

organismos de control de calidad listados en el paquete.

2. Las tarjetas de control de calidad utilizan 7 dígitos, compuestos de 2 partes:

3. Los primeros 6 dígitos identifican el tipo de tarjeta y un organismo ATCC.

   El séptimo dígito identifica el número de lote.

   de test y un organismo. Un número de referencia de control de calidad es más

   que un número de identificación de tarjeta. Cada uno de éstos números significa

   la paridad de un tipo de tarjeta con un organismo. Así por ejemplo el número de

   referencia 900101 corresponde al Proteus mirabilis ( ATCC 7002 ) y el 900102

   a la Ps. aeruginosa ( ATCC 27853 ).

4. Cada número predefinido de referencia en el control de calidad significa un tipo
5. Un campo para control de calidad demográfico está accesible para la información del lote de la tarjeta.
6. El control de calidad provee su propio set especial de reporte.
7. El flujo de operación del control de calidad es idéntico al flujo de una muestra clínica.
8. Los resultados de control de calidad se transfieren de la incubadora/lector a la base de datos, si la opción de transferir la tarjeta finalizada está activa.
9. Todos los resultados se mueven a través del manejador de desviaciones del control de calidad, el cual compara los resultados actuales con los conocidos.
10. El programa de control de calidad Vitek permite ver los resultados del control en pantalla., los cuales aparecen en 3 diferentes formatos: Resultado de la identificación, resultado de la sensibilidad a los antibióticos y Resultado de la Identificación de Urocultivos. La pantalla nos indica :

• La identificación del organismo esperado ( ATCC ).
• Resultado de la identificación actual.
• Lote de la tarjeta.
• Fecha del test.
• Fecha de expiración de la tarjeta.
• Reacciones bioquímicas esperadas y de la prueba actual. Cada uno de los test bioquímicos son señalados tanto en lo esperado como en el resultado actual, y se genera una lista de los test que se han desviado del resultado esperado.
• Igual patrón al anterior muestra la tarjeta de sensibilidad a los antibióticos.
• Todos los resultados de control de calidad pueden ser imprimidos para guardar en un libro récord.

2. La base de datos de los equipos de identificación computarizados, deben ser

3. frecuentemente revisados para actualizarlo en lo referente a los cambios

   taxonómicos que ocurran. Igualmente se debe prestar atención a la información

   proveniente de la casa manufacturera acerca del producto y las investigaciones

   que con el equipo aparezcan en la literatura especializada.

4. El sistema Vitek también cuenta con un programa que ayuda a evaluar los resultados, minimizando los errores de interpretación. Se trata del bioMérieux Vitek Expert System, un programa que usa la lógica proposicional, es decir llega a ofrecer ciertas conclusiones basado en la información formulada.

El programa puede detectar:

• Identificaciones que son inconsistente con los resultados de sensibilidad.
• Errores técnicos.
• Fenotipos raros o improbables.
• Expresiones de resistencia incompleta.
• Resistencia cruzada.

2. El sistema también permite la adición de reglas ( CAR ) en la que se establecen parámetros que debe cumplir el reporte antes de su impresión.

1. Sistema Bactec MGIT 960 :

El sistema Bactec MGIT 960 es utilizado para la detección temprana de micobacterias en especímenes clínicos. El control de calidad del instrumento es automático y está activo continuamente para asegurar la operación confiable del sistema.

El reporte de control de calidad suministra una lista del estado de todos los detectores del instrumento con la fecha y hora de la última verificación, e incluso la lista de las celdas bloqueadas, temperatura de cada incubadora, estado de los sensores, etc.

Control Diario del Equipo:

1. Verificar la operación de las gavetas/incubadoras y las lámparas indicadoras de estación.
2. Realizar test de las luces LED indicadoras ( Verde y Roja ).

   Cada vez que se recibe un lote nuevo de tubos MGIT , se sugiere control de calidad de cepas ATCC en caldo Middlebrook 7H9.

   ______________________________________________________________________

   Especie ATCC Dilución 0.5 McFarland Días para ser detectado

   ( Suspención en salina ) Positivo

   ______________________________________________________________________

   M. tuberculosis 27294 1:500 6 – 10

   M. kansasii 12478 1:50000 7 – 11

   M. fortuitum 6841 1:5000 1 – 3

   ______________________________________________________________________

   Control de Calidad Negativo:

3. Chequear el termómetro apretando el botón de test.
4. Utilice un frasco MGIT con solución descontaminante MycoPrep kit y PANTA ( Mezcla antimicrobiana ). colóquelo en la incubadora/detector.
5. Colocar un frasco de MGIT sin muestra y sin descontaminante y colóquelo en la incubadora/detector.
6. Inocule una suspensión de E. coli dentro de un tubo MGIT y colóquelo dentro de la incubadora/detector.

Control de Calidad Positivo:

1. Inocule un frasco de MGIT con una cepa control doméstica de Mycobacterium tuberculosis o una cepa control de M. Tuberculosis ATCC 25177

2. o M. Intracellulare ATCC 13950 y colóquelo en la incubadora.

3. Es importante comprobar que el agua, reactivos de tinción, suplementos, etc, están libres de contaminación por micobacterias ambientales especialmente

M. Gordonae y M. Terrae.

2. CONTROL DE CALIDAD DE FORMULAS LACTEAS y

MAMADERAS PARA EL SERVICIO DE NEONATOLOGIA :

El control de calidad de las fórmulas lácteas y sus mamones se realiza como un servicio al Departamento de Neonatología del hospital. Básicamente éste control consiste en un recuento bacteriano de bacterias mesófilas y recuento de bacilos coliformes.

Consideraciones referentes al control de calidad de formulas y mamaderas:

1. Mantener control sobre la esterilidad de los platos Petri y las pipetas.
2. Si al calentar los tubos para diluir el agar base o el Red Bile presentaran turbidéz, descartar ya que es signo de contaminación del medio.
3. Es preferible no mezclar por inversión la leche para homogenizar, ya que se puede salpicar la parte interna de los mamones y si hubiera contaminación de la leche, ésta se puede extender al mamón afectando la calidad de los mismos.
4. Evitar servir muy calientes el agar base o el Red Bile al plato Petri conteniendo la muestra a evaluar, ya que se pueden matar los posibles gérmenes. Una temperatura de aproximadamente 30-40 °C es apropiada, sin dejar coagular el agar.
5. Mezclar homogéneamente el agar y la muestra rotando el plato y sin permitir la formación de coágulos.
6. Las fórmulas lácteas solo pueden guardarse en refrigeración por un máximo de 48 horas antes de ser procesadas.
7. En condiciones normales la leche y los mamones deben ser estériles, especialmente no deben contener bacterias coliformes.
8. Si repetitivamente se observa contaminación de la leche, solicitar a las nutricionistas encargadas de la supervisión de la preparación de las fórmulas, una muestra de leche en polvo para un cultivo directo y una muestra de agua, si fuera necesario.

NOTA: Solo como referencia se describen los grados de leche pasteurizada establecidos en Panamá, mediante el decreto # 522 de 1957

Grado A : El recuento bacteriano no debe exceder de 30,000 col/ ml.

Recuento de coliformes no mayor de 10 col/ml.

Grado B: El recuento bacteriano no debe exceder de 50,000 col/ml.

Recuento de coliformes no mayor de 10 col/ml.

2. CONTROL DE CALIDAD DEL AGUA DESTILADA :

El agua destilada utilizada en la preparación de medios de cultivos y para reconstituir reactivos, debe tener un control de calidad básico que incluye los parámetros químicos y bacterianos.

Control de Calidad Químico :

Este control puede ser realizado teniendo en cuenta una gran variedad de parámetros a evaluar, tales como :

• Ph
• Conductividad
• Olor
• Color aparente
• Turbidéz
• Alcalinidad
• Dióxido de carbono
• Dureza
• Iones
• Cationes
• Metales pesados

Sin embargo, dadas las limitaciones para realizar un estudio profundo, recomendamos el siguiente método sencillo y apropiado para determinar la calidad del agua, aparte de la determinación de su Ph ( 5.0 – 5.5 ).

Reactivos:

a) Solución Acuosa de Nitrato de plata ( NO3Ag )

NO3Ag ……… 5.1 g

Agua destilada ………… 300 ml

b) Acido Nítrico

Método:

Colocar en un vaso químico limpio :

10 ml de agua destilada a examinar

2 gotas de ácido nítrico

1 ml de Solución de NO3Ag

Evaluación:

El agua deberá continuar completamente clara. Si aparece una ligera turbidéz

blanquecina, indicará que la calidad es deficiente.

Ref: manual de Técnicas Básicas OPS/OMS N° 439, pag. 58

Control de Calidad Microbiológico del Agua destilada:

• Agregar 1 ml de agua destilada a examinar, a un tubo de Tioglicolato.
• Agregar 1 ml de agua destilada a examinar a un plato de agar sangre.
• Incubar a 35.5 °C por 4 días.
• Llevar un libro récord del control de calidad del agua.

1. EL CEPARIO :

Los sistemas de Validación son los procesos que se requieren para asegurar que los parámetros de funcionamiento de los test, tanto comerciales como los de uso domésticos, son los esperados y las pruebas pueden ser utilizadas como métodos de diagnóstico en el laboratorio. La mayoría de los procedimientos en Microbiología Clínica, dependen de que los microorganismos viables en el cultivo sean capaces de mantener sus características morfológicas , fisiológicas y que sean típicas y reproducibles. Para ayudar en este control, las Cepas Estándar de Control de Calidad, son un componente esencial de un proceso de validación.

Existen varias colecciones de cepas utilizables para el control de calidad. Algunos ejemplos son:

ATCC : American Type Culture Collection- Rockville, USA

NCIC : National Collection of Industrial Bacteria- Survey, Inglaterra

JFCC: Japanese Federation of Culture Collection of Microorganism- Japón

CCTM : Colección Nacional – Lille, Francia

RIA: USSR Reseach Institute for Antibiotics- Moscú, Rusia.

NCIB : Colección Nacional industrial – Aberdeen, Escocia

DSM : Deutsche Sammlung von Mikroorganismen – Gottinger, Alemania.

Así, la E. coli ATCC 25922 es igual a la DSM 1103 y a la NCIB 12210.

Los organismos que han de ser utilizados en el control de equipos o sistemas de identificación, generalmente son estipulados por los fabricantes o bien escogidos por el usuario. Generalmente se utilizan cepas de referencia como las ATCC y si son cepas domésticas, es necesario tener un historial del organismo que incluye nombre, área de aislamiento, reacciones bioquímicas y patrón de sensibilidad a los antibióticos, forma de almacenaje, fecha de último transplante, etc

En todo caso, las cepas de referencia deben tener requisitos específicos:

• Características típicas.
• Características estables.
• Reproducibilidad

1. Métodos de Conservación de Cepas Bacterianas:

Los métodos de conservación de las cepas estándar de control de calidad, deben asegurar que las mismas mantengan sus características típicas y que puedan ser reproducidas después. El medio utilizado para su conservación debe mantener un mínimo de mutaciones. Estas mutaciones pueden evitarse permitiendo también el mínimo crecimiento del microorganismo y aportando óptimas condiciones ambientales para su sobrevivencia, con el menor número de subcultivos

Para una mejor clasificación de los métodos de conservación de cepas, los dividiremos en tres categorías: Cultivos Stock, Semistock y Cultivos de Trabajo diario.

a) Cultivos Stock:

Estos representan el verdadero " Banco de Cultivos" . Estos son mantenidos en un sistema cerrado de conservación, minimizando su actividad genética y fisiológica,

para evitar su potencial mutación.

Los dos más importantes métodos para conservación en Stock, son la Liofilización y el Ultracongelamiento.

LIOFILIZACION: Se hace una suspensión fuerte de un cultivo puro y joven en leche estéril o similar, y se coloca en tubos con rosca y se siguen las instrucciones del aparato liofilizador, que puede ser tan sencillo como un simple bomba de vacío, hasta un sofisticado sistema. Durante este proceso evitar que el cultivo se derrame dentro el aparato liofilizador y la formación de aerosoles

Este sistema tiene la ventaja de ser el que permite la sobrevivencia por un mayor periodo de tiempo y mayores facilidades para el transporte de las cepas.

ULTRACONGELAMIETO: Hacer una suspensión fuerte de la colonia pura en caldo Brucella conteniendo 15% de glicerol o sustituto. Dispensar en pociones de 0.5 ml en pequeños tubos con rosca y coloque en lo profundo del congelador a -45°C..

También se puede utilizar la modificación de Ultracongelamiento en Nitrógeno líquido, que consiste en colocar en una ampolla especial dentro de un aparato específicamente designado para el mantenimiento de cepas en nitrógeno líquido.

Ambos sistemas preservan las bacterias por largos periodos de tiempo.

b) Cultivos Semistock:

Este término se refiere al mantenimiento de cultivos por un periodo intermedio entre el relativamente permanente cultivo en Stock y el cultivo de cepas control para el trabajo diario. De las 5 técnicas listadas a continuación, solo la de congelamiento es utilizable para el mantenimiento de cepas de anaerobios.

1. Los congeladores convencionales pueden mantener una temperatura entre

   -10 a –25°C. Los cultivos se preparan de la misma manera como en el caso de la ultracongelación y son colocados en el congelador. El método permite la sobrevivencia de bacterias y levaduras en algunos casos por años y en la mayoría de las veces por al menos de 6 a 12 meses.

2. Congelamiento en congelador convencional :

   Se preparan tubos con rosca conteniendo Cisteína- Tripticasa y Soya agar.

   Inocular el cultivo puro y joven e incube por 18 a 24 horas para obtener un crecimiento moderado, afloje la tapa y mantenga a temperatura ambiente o preferiblemente en refrigeración, si es posible en la oscuridad. Microorganismos menos delicados sobreviven bien por un año y los fastidiosos por 6 meses.

3. Cultivo en CTA:

   Este método es conocido también como método Stamp en honor de su creador. Corte pequeños círculos de papel encerado y colóquelo en un plato Petri de vidrio. Esterilice en autoclave por 15 minutos a 15 libras de presión.

   Prepare una suspensión de caldo nutriente con 10% de gelatina en polvo

   ( Peso por Volumen ) y 0.25% de ácido ascórbico ( P x V ) y dispense en

   tubos con rosca y esterilice en autoclave.

   Haga una suspensión fuerte de un cultivo puro y joven y coloque una gota del

   mismo con una pipeta estéril sobre uno de los discos de papel acerado

   estéril en un plato Petri. Con una pinza estéril, transfiera el disco a un

   desecador de vacío conteniendo Pentaóxido de fósforo. Evacue el desecador

   con la bomba de vacío. Cuando el disco está seco, asépticamente introducir

   en un tubo estéril con tapa de rosca y colocar en el refrigerador.

   Para hacer un subcultivo del disco, asépticamente retire un círculo de papel

   con las colonias y colocarlo en un tubo conteniendo un caldo de cultivo e

   incubar por 24 horas a 35C y luego hacer transplante a agar sangre e incubar

   nuevamente.

4. Secado en discos con gelatina:

   Es un método especialmente utilizado para hongos, pero es útil también para algunas bacterias.

   En el caso de los hongos, se utiliza un cultivo joven y bien esporulado en un medio de cultivo inclinado, tal como agar de Sabouraud-dextrosa. Cubrir completamente con aceite mineral estéril. El aceite debe ser esterilizado a 15 libras de presión por 45 minutos, para asegurar su esterilidad absoluta.

   Para reactivar la cepa, colocar la boca del tubo cerca de la llama de un mechero o incinerador y remueva una porción visible de crecimiento con una asa estéril larga o una aguja.

   Este método permite la sobrevivencia por muchos años.

   Si el método se va a utilizar para conservar bacterias, se utiliza Agar de Cerebro-Corazón o agar Mueller-Hinton suplementados con hemoglobina al 2% e Isovitalex al 1%. Los medios se sirven en tubos con rosca. Se esterilizan y luego se les hace coagular en forma inclinada.

   Las bacterias son inoculadas en el medio e incubadas a 35°C por 24 horas, tomando en cuenta sus requerimientos de oxígeno. Luego las cepas son cubiertas con aceite mineral estéril, hasta 1 cm por encima del final del inclinado. Los cultivos son viables por 2 años a temperatura ambiente.

5. Conservación en medio de cultivo inclinado con aceite mineral:
6. Mantenimiento en tierra estéril:

Es utilizado primeramente para hongos y bacterias esporuladas.

Esterilice en autoclave tierra suelta en tubos con rosca a 15 libras de presión por 1 hora. Haga una suspención fuerte del microorganismo joven y esporulado y colóquelo en el tubo con tierra estéril. Deje secar y colocarlo en un refrigerador.

1. Cultivos de trabajo diario:

Los cultivos control para el trabajo diario, son una forma conveniente para realizar el control de calidad de pruebas de uso frecuente y que requieren una lectura comparativa al momento de su lectura. Tal es el caso de las pruebas de coagulasa y oxidasa, entre otras. Para éste propósito se utilizan cultivos de 24 horas y son transplantados diariamente.

• Bacterias resistentes:

Tal es el caso de Estafilococos y Enterobacteriaceas. Se transfiere una colonia joven de un cultivo en Stock o semistock y se transfiere a un tubo con agar nutritivo inclinado e incubar por un mínimo de tiempo tal que haya crecimiento. Guardar en refrigerador. Los cultivos para trabajo diario, son transferidos a otros tubos de agar inclinado cada mes por un intervalo de 6 meses. Después de éste tiempo, se debe volver a hacer otro pase del cultivo stock.

• Bacterias delicadas :

Los cultivos de trabajo diario de organismos delicados como

N. Meningitidis, N. Gonorrhoeae, S. pneumoniae y algunos menos delicados como el S. pyogenes, son preparados a partir del stock e incubados por 24 horas en medios apropiados como agar chocolate en ambiente de CO2 , para luego ser colocados en refrigeración. Después de una serie de 6 transplantes consecutivos, se debe preparar otro cultivo para uso diario a partir de la cepa en stock.

• Bacterias anaeróbicas:

Los cultivos para trabajo diario de la mayoría de las bacterias anaeróbicas, pueden ser mantenidos en medio de carne cocida o en Tioglicolato con

0.5% de carbonato de sodio adicionado después de esterilizar por autoclave.

Los cultivos se incuban por 24 a 48 horas y guardados a temperatura ambiente.

• Hongos:

Los cultivos de uso diario de hongos, son mantenidos en tubos con agar Sabouraud o sustituto.. Los cultivos se incuban a temperatura ambiente hasta que haya crecimiento, y ocurra la esporulación, para luego ser colocados en refrigeración. Los cultivos de trabajo deben ser transferidos cada 2 meses . Pasado éste tiempo se debe preparar otro cultivo de trabajo a partir de la cepa en stock.

• Cultivos de trabajo comerciales:

Son preparados por casa comerciales utilizando cepas conocidas como la ATCC.. Estas son estables en refrigeración por un año. Tal es el caso de Bact-Chek de Roche Diagnostics, Bactrol Disk de Difco, entre otras.

Para reactivar las cepas se colocan en un caldo nutritivo como el caldo de Tripticasa y Soya e incubados por 24 horas a 35°C. Luego se hace un transplante a un medio de enriquecimiento o a agar sangre.

2. Se debe tener especial cuidado en el mantenimiento del cepario, ya que el mismo constituye una ayuda importante en la validación de equipos, materiales, reactivos y habilidad del personal. Debe existir un programa metódico de transplantes de cepas , archivo de cada uno de los cultivos con sus características bioquímicas, sensibilidad a los antibióticos, origen de la cepa, método de identificación, fecha de siembra y próximo transplante, etc

3. Mantenimiento del Cepario:

   En nuestro medio por situaciones muy especiales y altamente beneficiosas,

   podemos tener acceso a las cepas control del American Type Culture

   Collection ( ATCC ) , la colección más grande e importante del mundo. Estas

   cepas bacterianas pueden ser utilizadas como control en una gran variedad de

   utilidades, lo cual nos permite conocer el grado de confiabilidad de los productos

   comerciales o elaborados en el laboratorio.

   A continuación algunas referencias de las cepas ATCC:

   Microorganismo ATCC Medio Característica

   E. coli 25922 McConkey Colonia rosada

   S. typhimurium 14020 McConkey Colonia incolora

   P. mirabilis 12453 McConkey Colonia incolora

   E. faecalis 29212 McConkey No crece

   St. pyogenes 19615 Agar sangre ß-hemólisis

   St. pneumoniae 6305 Agar sangre alfa-hemólisis

   S. epidermidis 12228 Agar sangre no hemolítico

   Candida albicans 60193 Agar sangre no hemolítica

   Candida albicans 60193 Tubos germinales Positivo

   Candida tropicalis 66029 Tubos germinales Negativo

   Microorganismo ATCC Medio Característica

   S. aureus 25922 Manitol sal Colonia amarilla

   S. epidermidis 12228 Manitol sal Colonia incolora

   P. mirabilis 12453 Manitol sal No crece

   M. tuberculosis (TBC) 2577 Low-Jensen Crece. Incoloro

   M. kansassi ( I ) 12478 Low-Jensen Crece. Amarillo + luz

   M. scrofulaceum (II ) 19981 Low-Jensen Crece. Amarillo – luz

   M. intracellulare ( III ) 13950 Low-Jensen Crece. Incoloro

   M. fortuitum ( IV ) 6841 Low- Jensen Crece. < 7 días.

   E. coli 25922 Low-Jensen No crece

   LISTADO DE CEPAS ATCC SUGERIDAS PARA CONTROL DE CALIDAD

   MICROORGANISMO ATCC

   Campylobacter jejuni ………………………………………. 33290

   Enterococcus faecalis ……………………………………….. 29212

   Escherichia coli………………………………………………… 25922

   Escherichia coli ……………………………………………….. 35218

   Proteus vulgaris ………………………………………………. 8482

   Pseudomona aeruginosa …………………………………… 27853

   Salmonella typhimurium …………………………………. 14028

   Shigella sonnei ……………………………………………….. 9290

   Shigella sonnei ……………………………………………….. 25911

   Shigella flexnerii …………………………………………….. 12022

   Enterobacter aerogenes ……………………………………. 13048

   Staphylococcus aureus …………………………………….. 25923

   Staphylococcus aureus …………………………………….. 29213

   Staphylococcus epidermidis ……………………………… 12228

   Steptococcus pyogenes …………………………………….. 19615

   Streptococcus pneumoniae ………………………………… 6305

   Streptococcus pneumoniae ………………………………… 49619

   Streptococcus faecalis ……………………………………….. 19433

   Haemophilus influenzae …………………………………….. 49247

   Haemophilus influenzae …………………………………….. 49766

   Neisseria gonorrhoeae ……………………………………….. 49226

   Escherichia coli 0157:H7 …………………………………… 43894

   Bacteroides fragilis ……………………………………………. 23745

   Clostridium perfringes ……………………………………….. 3624

   Clostridium sporogenes .…………………………………… 19404

   Clostridium tertium …………………………………………… 19405

   Clostridium novyi A …………………………………………. 19402

   Fusobacterium necrophorum …………………………………25286

   Fusobacterium nucleatum ……………………………………..25586

4. Cepas ATCC:
5. Transporte de cepas bacterianas:

La mayoría de las naciones han implementado regulaciones internacionales para el empaque y transporte de materiales biológicos potencialmente nocivos para el hombre o los animales. Estas reglas intentan proteger al público de accidentes al tener contacto directo o indirecto con dichos productos. El personal que prepara éste envío debe ser apropiadamente entrenado en las formas de empaque y en las regulaciones internacionales que lo rigen.

Solo como una guía enumeraremos algunas regulaciones foráneas:

• U.S Public Health Service, 42 CFR part 72,

Interstate shipments of Etiologic Agents.

• International Air Transport Association.

Dangerous Goods Regulations.

• Unites Nations

Recommendations of the Committee of Experts on the Transportation of Dangerous

Goods.

• U.S Department of Labor, Occupational Safety and Health Administration, 29 CFR

Part 1910.1030, Bloodborne Pathogens.

Generalmente el transporte de agentes etiológicos requiere un doble o triple empaque, dependiendo de las regulaciones del país de destino. Si la cepa está contenida en un tubo de vidrio, se recomienda que sea pequeño y de vidrio grueso. Este a su vez debe estar inmerso en un envase de metal con material aislante como el aserrín o foam desmenuzado. A éste envase se le puede adicionar otro que contenga igualmente aserrín o foam , dependiendo de las regulaciones y por último la caja externa no porosa, con recubrimiento de cera en su interior y a prueba de derrame. En ésta caja irán las etiquetas , guía aérea, etiquetas de advertencia, números telefónicos para contactar en caso de emergencia, tanto en el país de origen como en el de destino. Igualmente se etiquetará con un símbolo de material peligroso de color rojo.

1. SUPERVISON DEL PERSONAL:

El personal es el factor más importante en la calidad del trabajo en el laboratorio de microbiología. Este personal debe tener una dedicación y actitud positiva hacia el trabajo, capacidad académica, actualización constante y contar con los elementos indispensables para su labor.

1. Evaluación del personal:

La competencia del personal de microbiología, debe ser certificada por la revisión de su hoja de trabajo, la interpretación de muestras desconocidas , su habilidad técnica y exámenes escritos anuales. Se debe llevar un registro profesional acerca de su evaluación académica, reporte sobre su capacidad de trabajo, asistencia a programas de educación continuada, responsabilidad, asistencia, trabajos de investigación, charlas, conferencias y su evaluación profesional anual.

Todo nuevo empleado que se adicione a la plantilla de la sección, debe ser documentado, evaluado y certificado, incluyendo las fases pre-analíticas, analíticas y post-analíticas de funcionamiento del laboratorio.

2. Programa de docencia:

Un elemento fundamental en el mantenimiento apropiado de la competencia del personal es el programa de educación continuada. Este programa mantiene al personal informado en los avances en la detección e identificación de agentes etiológicos, nuevos test, equipos, cambios en la taxonomía bacteriana y la evaluación correcta de las pruebas de sensibilidad a los antibióticos.

Este programa puede incluir charlas, mesas redondas, lecturas de artículos de interés, discusión de casos clínicos, evaluación de nuevos test o equipos, revisión de la literatura sobre temas específicos, trabajos de investigación, etc. Se debe llevar un control sobre la participación individual del personal en el programa, su asistencia y actividad, lo cual formará parte de su evaluación anual.

3. Evaluación del informe final:

El resultado final de la evaluación de un espécimen clínico luego de cumplir con todas las etapas de investigación, es el informe final que implica una identificación etiológica, si la hubiera, y su correspondiente sensibilidad a los antibióticos. Para llegar a éste resultado, el laboratorio de microbiología debe haber agotado todos los elementos diagnósticos de que dispone y hacer un juicio respecto a la posibilidad de que dicho informe represente el potencial agente infeccioso, tomando en cuenta los factores que están involucrados tales como el tipo de muestra, microorganismo aislado, edad del paciente, procedencia, informes previos, frotis directo y el patrón de comportamiento frente a los antibióticos, entre otros.

En todo informe final debe prevalecer el concepto de rapidez y seguridad diagnóstica. Es recomendable y así está establecido en Manuales foráneos, que los resultados sean evaluados antes de su envío por un el jefe del laboratorio de microbiología o en su defecto por un Supervisor con experiencia y capacidad demostrada, con el fin de minimizar potenciales errores, omisiones o interpretaciones del informe final, tomando en cuenta el valor que éste reporte tendrá en la evaluación, tratamiento y la salud del paciente.

Es importante en ésta etapa establecer los " Valores de Alerta " en microbiología, los cuales son aquellos resultados de mayor preponderancia, ya sea por el tipo de microorganismo involucrado o por su significado en el control de enfermedades de notificación obligatoria.

VALORES DE " ALERTA " EN MICROBIOLOGIA

* Organismos vistos en LCR * Tinta china positiva

* Detección de antígenos de Cryptococcus * Detección de antígenos de LCR

* Frotis BAAR positivos * Hemocultivos positivos

* Cultivo de LCR positivo * Aislamiento de M. Tuberculosis

VALORES DE " ALERTA " EN MICROBIOLOGIA

* Aislamiento de Shigella sp * Aislamiento de Salmonella typhi

* Aislamiento de E. coli 0157:H7 * Aislamiento de Neiserias patógenas.

* Aislamiento de Estafilococos resistentes a la Vancomicina.

* Aislamiento de agentes etiológicos de notificación obligatoria.

Cuando se observen " Valores de Alerta " , se debe notificar al jefe de la sección.

4. Control de calidad externo:

Es recomendable que los laboratorios de microbiología puedan participar en programas de evaluación externa. Estos programas miden la capacidad del laboratorio para evaluar un desconocido y llegar a un resultado seguro. Los mismos consisten en la identificación de muestras o microorganismos desconocidos en los cuales se debe informar del resultado de la identificación, pruebas utilizadas para el diagnóstico etiológico y sensibilidad a los antibióticos.

El Director del laboratorio debe escoger el programa que sea consistente con el nivel de calidad de su laboratorio. Generalmente estos desconocidos vienen con un abstracto clínico y son recibidos al menos 2 veces al año. Los laboratorios que ofrecen éstos programas invalidan aquellos laboratorios que fallan en responder el cuestionario, por lo que es necesario mantener un contacto muy especial para no perder éste beneficio. Los resultados de la evaluación de los desconocidos deben ser discutidos por todo el personal antes de su informe al laboratorio generador del programa.

Algunos laboratorios que ofrecen programas externos de evaluación de la calidad son :

1. Accutest:

2. POBox 999

   Westford, MA 01886-0031

   205 West Levee Street

   Brownsville, TX 78520-5596

3. American Association of Bioanalysts Proficiency Testing Service
4. American Proficiency Institute

1159. Business Park Drive

Traverse City, MI 49686

1. The College of America Pathologists- Survey

College of American Pathologists

325. Waukegan Road

Northfield, Il 60093-2750

1. Idaho Bureau of Laboratories Proficiency Testing Program

2220. Old Penitenciary Rd.

Boise, ID 83712

1. 2011 Pensnsylvania Av, NW, Suite 800

   Washington, DC 20008-1808

2. Medical Laboratory Evaluation (MLE ).

   Trenton, NJ 08625-0360

   USA

3. New Jersey Department of Health Proficiency Testing Program, CN 360

   110 Eastlake Avenue East

   Seatle, WA 98109

4. Pacific Biometrics

   Laboratory Service Program

   Department of Health of Puerto Rico, Bulding A

   Call Box 70184

   San Juan, Puerto Rico 00936

   ( Tel. (800)-769-7774 )

5. Puerto Rico Department of Health
6. Universitair Ziekenhuis St. Rafael B-300

Bacteriologie

Leuven – Belgium

Att: Prof. Dr. J. Vandepitte

Prof. J. Verhaegen

Tel. 0032-16-332150

Fax. 0032-16-336321

5. Certificación del laboratorio de microbiología:

Un nuevo concepto en la organización de los laboratorios es la acreditación a Asociaciones especializadas que promueven la excelencia en la calidad de los servicios de sus miembros. Esta calidad está enfocada no solo en los aspectos técnicos, sino también en los administrativos, racionalización de recursos, planificación gerencial, costos de operaciones, calidad de servicio al cliente, es decir, un enfoque de Calidad Total. En los Estados Unidos éstas acreditaciones están validadas por asociaciones como la American Society for Microbiology, College of American Pathologists,

American Association of Bioanalysts, etc. En Latinoamérica algunas asociaciones de laboratorios han creado comités de acreditación para laboratorios públicos y privados.

El enfoque moderno en un mundo en que las distancias se han acortado y los conceptos de globalización son una realidad, la acreditación proporciona a los miembros la posibilidad de comunicarse mejor con otros laboratorios del mundo, lo cual permite un intercambio de experiencias en metodologías, compra de equipos, entrenamiento de personal, etc

Los problemas legales y altos costos de operaciones, han obligado a los grandes laboratorios a encontrar un modelo aún más complejo de aseguramiento de la calidad, con el fin entre otros, de bajar costos. La Organización Internacional de Estándares ha desarrollado una guía llamada ISO 9000 que establece un flujograma de trabajo en los programas de aseguramiento de la calidad y unifica los diferentes actividades del control de calidad. La categoría apropiada para los laboratorios clínicos en general es el ISO 9002 el cual comprende 18 elementos de control. Para que un laboratorio pueda ser certificado bajo la norma ISO, debe cumplir con todos los elementos del estándar.

En éstos casos un equipo de Aseguramiento de la Calidad implementa las medidas en cada una de las área con el fin de que cuando se esté listo, pueda pasar las pruebas a que es sometido todo el sistema por parte de auditores certificados. La obtención de ésta certificación ISO 9002 es el máximo galardón a la excelencia en control de calidad en los laboratorios clínicos.

1. PROFORMAS DE REPORTE DEL CONTROL DE CALIDAD:

Se adjuntan a continuación las hojas proformas utilizadas para llevar el registro del control de calidad en microbiología:

1. Libro de reporte de control de calidad de medios en platos.

2. 2) Libro de reportes de control de calidad de medios en tubos.

3. Libro de reporte de control de calidad de antisueros y reactivos.

4) Libro de reporte de control de calidad de fórmulas lácteas y mamaderas.

5) Libro de reporte de control de calidad de la sangre de carnero.

1. 6) Libro de reporte de control de calidad de los discos de sensibilidad a los

antibióticos.

7) Libro de control del cepario.

1. GLOSARIO DE TERMINOS ESTADISTICOS:

1. Azar: Condición de desorden sin predicción de los resultados individuales.

2. Coeficiente de Confianza: Oportunidad que tiene un intervalo de confianza de ser incluido en el valor universal.
3. Curtosis: Grado de agudeza de la curva.
4. Desviación Promedio: Es la desviación dividida por el número de determinaciones. Es un método que permite determinar la magnitud de la desviación estándar cuando se corren muchas pruebas.
5. Desviación Estándar: Raíz cuadrada del promedio de las desviaciones al cuadrado, de una media aritmética.
6. Distribución de Frecuencia: Agrupa los valores de una variable en orden de tamaño.
7. Distribución Normal: Distribución de datos en una frecuencia de tabulación que semeja una curva de campana.
8. Duplicados: Unidad o espécimen que se ha producido bajo las mismas condiciones.
9. Exactitud: Desviación de un valor estimado, del valor real.
10. Error Experimental: Desviación del valor esperado, debido a las limitaciones de la metodología o de la producción.
11. Error Relativo: Error medio en una serie de pruebas, que representan un porcentaje del valor verdadero.
12. Error Estándar: Error alrededor de la media de una serie de pruebas.
13. Error medio: Diferencia entre el resultado verdadero y la media obtenida.
14. Factor de Corrección: Es una constante aplicada a valores observados en muestreos pequeños, con el fin de obtener un mejor ajuste de datos a la distribución teórica chi cuadrado ( xª ).
15. Factores Fijos: Factores, variables o efectos que son constantes o iguales para todas las muestras.
16. Grado de Libertad: Es el número de diferencias independientes o variaciones posibles en las observaciones individuales. Si solo hay una observación, entonces hay un grado 0 de libertad, ya que no hay otra observación para comparar.
17. Histograma: Diagrama de barras que representan la frecuencia de distribución.
18. Homocentesis: Distribución uniforme a ambos lados de la media.
19. Interacción: Tendencia a la combinación de dos variables de manera que el resultado difiere de la suma de sus actividades independientes.
20. Límite de Confianza: Límite alto y bajo de un intervalo de confianza.
21. Muestra: Grupo de datos o elementos utilizados en el estudio.
22. Mediana: Línea de igualdad que divide la distribución en igual número de casos por encima o por debajo de la línea.
23. Media Aritmética: Suma de una serie de pruebas dividido por el número total.
24. Modo: Tipo de dato que tiene la mayor frecuencia, lo que indica el punto central de la tendencia.
25. Parámetro: Constante de un universo que describe una característica individual.
26. Probabilidad: Frecuencia relativa al azar. Varía del cero al uno.
27. Precisión: Exactitud en las determinaciones repetidas de una prueba. A menor desviación estándar, mayor precisión.
28. Punto Fuera ( Outlier ): Valor ubicado en una posición extrema, fuera de los límites aceptables.
29. Reproducibilidad: habilidad para repetir el mismo resultado en diferentes ocasiones.
30. Rango: Es la medida más sencilla de la variabilidad general que describe la diferencia entre el valor máximo y el mínimo.
31. Significativo: Resultados de la prueba que se salen de los límites de confianza.
32. Universo: La totalidad de los elementos del cual se toman las muestras para su tabulación.
33. Variabilidad: Es el cuadrado de la desviación estándar.

1. BIBLIOGRAFIA DE REFERENCIA:

1. Current Concepts and Approaches to Antimicrobial Agent Susceptibility

1. Testing. Cumitech # 25

   John McGowan – Coordinating Editor

2. Cumulative Techniques and Procedures in Clinical Microbiology.
3. A.S.M Press, American Society for Microbiology,
4. Washington DC

2. New Developments in Antimicrobial Agent Susceptibility Testing: A

Practical Guide. Cumitech # 6ª.

Cumulative Techniques and Procedures in Clinical Microbiology.

John McGowen – Coordinating Editor

A.S.M Press, American Society for Microbiology,

Washington DC.

1. Laboratory. Cumitach # 31.

   Cumulative Techniques and Procedures in Clinical Microbiology.

   Brenda McCurdy – Coordinating Editor

   A.S.M Press, American Society for Clinical Microbiology,

   Washington DC.

2. Verification an d Validation of Procedures in the Clinical Microbiology

   Cumitech # 3 A.

   Cumulative Techniques and Procedures in Clinical Microbiology,

   Alice Weisfeld – Coordinating Editor.

   A.S.M Press, American Society for Microbiology,

   Washington DC.

3. Quality and Quality Assurance Practices in Clinical Microbiology.

   J. Michael Miller.

   A.S.M Press, 1998, American Society for Microbiology.

   Wsahington DC

4. A Guide to Specimen Management in Clinical Microbiology.

   Henry Isenberg – Editor in Chief.

   A.S.M Press, 1998, American Society for Microbiology,

   Washington DC

5. Essential Procedures for Clinical Microbiology.
6. Manual of Clinical Microbiology.

1. Edition, 1999,

Patrick Murray – Editor in Chief.

A.S.M Press, American Society for Clinical Microbiology,

Washington DC.

1. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology.

1. Demian and N. Solomon.

A.S.M Press, 1997, American Society for Microbiology,

Washington, DC

10. Food Microbiology: Fundamentals anf Frontiers.

M. Doyle, L. Beuchat and T. Montuille.

A.S.M Press, 1998, American Society for Microbiology.

Washington, DC

11. Quality Assurance in the Clinical Microbiology: Applying ISO 9000

Quality Standars.

1. Seidenfeld, C. Glidden and D. Henrickson

Clinical Laboratory News, 1997 ; 23 (8), 11-15.

The American Association for Clinical Chemistry,

Washington DC.

12. Normativa para la Puesta en Práctica de Estudios de la Sensibilidad

Antimicrobiana Mediante Discos.

Sexta Edición, Approved Standard

NCCLS – Comité Nacional para Normas de Laboratorio Clínico.

M2 – A6 . Vol. 13, N°24.

The National Committee for Clinical Laboratory Standard Press,

Pennsilvania, USA

13. Bacteriología Diagnóstica: Tinciones, Medios de Cultivos y Pruebas

Diagnósticas.

F. Guerrero, M. Gamboa, J. Mora y E. Rodríguez.

Oficina de Publicaciones, Facultad de Microbiología,

Universidad de Costa Rica.

14. Normativa para la Puesta en Práctica del Estudio de Susceptibilidad

Antimicrobiana.

Octavo Suplemento Informativo.

NCCLS , M100 –S8 , Vol. 17, N° 2

Pennsilvania, USA.

15. Manuales Técnicos:

Merck, Menarini, Oxoid, Difco, BBL, Vitek, Biomerieux, Gibco y Sigma.

ANEXO:

CASAS SUPLIDORAS DE MATERIALES Y

EQUIPOS PARA EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

1. Apdo. 1689, Panamá 1, Panamá.

   Tel. 227-5311

   Fax. 227-5682

2. La Casa del Médico
3. Médica Internacional, S.A

Apdo. 1580, Panamá 1, Panamá

Te. 227-0721

227-5614

Fax. 227-5682

c) Promed, S.A

Calle 50 final, Edificio Los Leones

Tel. 226-1759

Fax. 226-3238

d) Inversiones Sagrav, S.A

Apdo. 2516, Panamá 9ª, Panamá

Vía Santa Elena, Urbanización Casa Blanca

Tel. 233-0902

233-3265

E-Mail: sagrav[arroba]sinfo.net

e) Alpha Médiq, S.A

Local #8, Centro Comercial Plaza Psari, S.A

Ave. de la amistad Bathania.

Apdo. 6-1392 El Dorado, Panamá

Tel. 236-5846

236-5286

Fax. 236-3586

E-Mail: alphamediq[arroba]cwp.net.pa

f) Rochem Biocare

Calle 44 Bella Vista

Tel. 225-4977

Fax. 225-4901

g) Servi-Lab

Apdo. 818-1165 Zona 6

Tel. 229-1233

261-3755

Fax. 229-3934

E-Mail:

h) Centro Médico Internacional, S.A

Calle 37 Este, N°2 Bella Vista

Apdo. 11102, Panamá 6, Panamá

Tel. 225-9256

225-9161

i) Compu Científica, S.A

Ave. Cuba, Calle 41 Bella Vista

Apdo. 7091, Panamá 5, Panamá

Tel. 227-3627

225-8446

Fax. 225-0847

Autor:

Lic. Eric Caballero J.

Licenciado en Tecnología Médica por la Universidad de Panamá.

Con 30 años de experiencia en Microbiología Médica Hospitalaria.

Miembro de la Asociación Americana de Microbiología y de la Academia de Ciencias de Nueva York.

E-Mail: